本發(fā)明專利技術(shù)公開了基于Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割體系及其應(yīng)用，所述核酸切割體系包括向?qū)NA、Argonaute蛋白TcAgo和報(bào)告核酸，所述TcAgo的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或如與SEQ ID NO.1具有至少85％的序列一致性且具有相同功能的序列所示，該核酸切割體系可應(yīng)用于核酸檢測(cè)、富集低豐度核酸和基因克隆等生物技術(shù)領(lǐng)域，且具有良好的應(yīng)用前景。且具有良好的應(yīng)用前景。且具有良好的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
基于Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割體系及其應(yīng)用
[0001]本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)
，具體涉及一種基于新型高溫Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割體系及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
[0002]Argonaute蛋白是一類存在于幾乎所有類型生物中并非常保守的基因家族蛋白，在真細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛分布。根據(jù)來源可分為真核Argonaute蛋白(eukaryotic Argonaute proteins,eAgos)和原核Argonaute蛋白(prokaryotic Argonaute proteins,pAgos)。目前，真核生物來源的Argonaute蛋白能夠在常溫條件下催化RNA向?qū)?gRNA)引導(dǎo)的RNA切割反應(yīng)，并在體內(nèi)的RNA干擾(RNA interference,RNAi)途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。原核生物來源的Argonaute蛋白相比eAgos功能和結(jié)構(gòu)更加多樣化，但其生理功能長(zhǎng)期以來難以捉摸。pAgos在宿主防御和DNA復(fù)制中起著重要作用，對(duì)一些pAgos(主要來自嗜熱細(xì)菌和古菌)的結(jié)構(gòu)和生化研究表明，它們?cè)隗w外可以發(fā)揮核酸內(nèi)切酶作用，在體內(nèi)可以發(fā)揮宿主防御作用。pAgos可以結(jié)合siDNA指導(dǎo)鏈來特異性剪切和指導(dǎo)鏈互補(bǔ)配對(duì)的DNA靶標(biāo)鏈。目前已經(jīng)報(bào)道的pAgos如PfAgo、TtAgo和MjAgo等主要來源于高溫宿主，多用于基因檢測(cè)。
[0003]嗜熱微生物來源的具有核酸內(nèi)切酶活性的pAgo核酸酶已被設(shè)計(jì)用于分子診斷，在病毒檢測(cè)中扮演著重要的角色。隨著越來越多微生物基因組的增加，使得我們迫切需要對(duì)pAgos進(jìn)行進(jìn)一步的挖掘和生化表征，以了解其基本的生物學(xué)作用并探索其在分子診斷中的應(yīng)用潛力。早期研究主要集中于高溫生物來源的pAgos，除了Marinitogapiezophila來源的MpAgo偏愛利用5
’
末端羥基化(5
’
OH)的gRNA切割靶單鏈DNA(single
?
stranded DNA,ssDNA)和RNA靶之外，其余高溫來源的pAgos都偏愛利用5
’
末端磷酸化(5
’
P)的向?qū)NA(gDNA)切割ssDNA靶和/或RNA靶。已經(jīng)報(bào)道的高溫pAgos可以在70℃及以上高溫條件下，結(jié)合單鏈gDNA或gRNA，剪切ssDNA靶，少數(shù)能剪切RNA靶，這限制了高溫Ago用于RNA編輯的體外應(yīng)用。目前已報(bào)道的來源于高溫生物的pAgos都是偏愛Mn
2+
切割ssDNA靶和/或RNA靶，在Mg
2+
條件下切割ssDNA靶和/或RNA靶的活性較低，而Mn
2+
在高溫條件下會(huì)造成核酸的非特異性降解，這影響了高溫pAgo用于核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0004]為了更好地豐富體外基因水平的操作工具，了解pAgos體內(nèi)生理功能和進(jìn)一步探索Argonaute蛋白的進(jìn)化過程，更多的Argonaute蛋白的體外功能需要被表征，特別是具有獨(dú)特性質(zhì)的Argonaute蛋白。多功能的或者全功能的pAgos的體外性質(zhì)表征顯得尤為重要。隨著越來越多病毒引起的疾病的發(fā)生，早期診斷能夠有效地預(yù)防疾病的進(jìn)一步爆發(fā)。高溫甚至于多功能pAgos的挖掘能夠豐富現(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)不依賴PCR和等溫?cái)U(kuò)增的核酸診斷，這可能可以規(guī)避已有的核酸檢測(cè)方法的弊端。另外，不能忍受單堿基錯(cuò)配的編程酶的出現(xiàn)可能可以解決假陽(yáng)性和假陰性的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
[0005]有鑒于此，本專利技術(shù)挖掘并表征了一個(gè)來源于高溫原核生物的新型Argonaute蛋白，該蛋白在向?qū)NA的介導(dǎo)下能夠?qū)崿F(xiàn)靶向DNA或靶向RNA的編輯，故可以應(yīng)用于核酸檢測(cè)、富集低豐度核酸和基因克隆等，為體外基因水平編輯提供了一種新的工具。
[0006]本專利技術(shù)的技術(shù)方案具體如下：
[0007]本專利技術(shù)首先提供了一個(gè)高溫Argonaute蛋白TcAgo，該蛋白具體為(A1)或(A2)：
[0008](A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；
[0009](A2)氨基酸序列與SEQ ID NO.1所示序列具有至少85％的序列一致性且與(A1)所述蛋白具有相同功能的蛋白。
[0010]具體的，對(duì)于(A2)所述蛋白，其序列是在SEQ ID NO.1所示序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的替換、缺失、改變或插入，或者在其N端或C端添加1至10個(gè)氨基酸殘基(較佳地，添加1至5個(gè)氨基酸殘基；更佳地，添加1至3個(gè)氨基酸殘基)，從而獲得的氨基酸序列。
[0011]優(yōu)選地，(A2)所述蛋白的氨基酸序列與SEQ ID NO.1所示序列具有至少90％的序列一致性；更優(yōu)選地，序列一致性≥95％，例如≥96％，≥97％，≥98％或≥99％。
[0012]本專利技術(shù)還提供了與所述高溫Argonaute蛋白TcAgo相關(guān)的生物材料，具體包括以下：
[0013](B1)編碼該Argonaute蛋白TcAgo的基因；
[0014](B2)含有(B1)所述基因的表達(dá)盒、載體或細(xì)胞；
[0015](B3)一種包括Argonaute蛋白TcAgo和單鏈向?qū)NA的pAgo復(fù)合物。
[0016]對(duì)于(B1)中所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或其核苷酸序列為與SEQ ID NO.2所示序列具有至少50％或至少80％的序列一致性的序列。
[0017]優(yōu)選地，基因序列與SEQ ID NO.2所示序列具有至少90％的序列一致性；更為優(yōu)選地，具有至少95％的序列一致性。
[0018]其中，SEQ ID NO.2所示序列的全長(zhǎng)為2400bp，SEQ ID NO.2所示的基因序列挖掘自破火山口熱菌屬(Thermogladius calderae)，其編碼的蛋白與PfAgo、MjAgo和TtAgo相比，序列一致性都低于30％并且都不在同一個(gè)進(jìn)化枝上。
[0019]利用(B2)中所述的載體和細(xì)胞，可體外重組制備Argonaute蛋白TcAgo。在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例中，將目的基因與pET28a質(zhì)粒連接得到重組載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到重組菌，誘導(dǎo)表達(dá)該重組菌、純化即得目的蛋白。
[0020]對(duì)于(B3)中所述的pAgo復(fù)合物，單鏈向?qū)NA的長(zhǎng)度為15～30nt，優(yōu)選為16～21nt，最佳為16～18nt；單鏈向?qū)NA為5
’
端磷酸化的單鏈DNA分子(5
’
P
?
gDNA)或5
’
端羥基化的單鏈DNA分子(5
’
OH
?
gDNA)，優(yōu)選為5
’
端磷酸化的單鏈DNA分子。
[0021]基于所述高溫Argonaute蛋白TcAgo，本專利技術(shù)進(jìn)一步提供了一個(gè)核酸切割體系，其包括：
[0022](a)向?qū)NA；
[0023](b)Argonaute蛋白TcAgo；
[0024](c)任選的報(bào)告核酸，若所述報(bào)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割體系，其特征在于，包括：(a)向?qū)NA；(b)Argonaute蛋白TcAgo；(c)任選的報(bào)告核酸，若所述報(bào)告核酸被TcAgo剪切，則所述剪切可被檢測(cè)出；其中，所述TcAgo的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如與SEQ ID NO.1具有至少85％的序列一致性且具有相同功能的序列所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割體系，其特征在于，所述向?qū)NA的5
’
端有羥基化或磷酸化修飾，且所述向?qū)NA的長(zhǎng)度為15～30nt。3.一種特異性切割靶核酸的方法，其特征在于，構(gòu)建如權(quán)利要求1所述的核酸切割體系，其中以靶核酸作為報(bào)告核酸；所述靶核酸為靶DNA或靶RNA，所述靶核酸具有與所述向?qū)NA互補(bǔ)配對(duì)的核苷酸序列時(shí)，所述TcAgo在向?qū)NA介導(dǎo)下特異性切割所述靶核酸。4.根...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳晚蘋，馬立新，陳苗苗，張成，王飛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：湖北大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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