丙酮酸激酶缺乏癥(PKD)基因編輯治療方法技術

本發明專利技術涉及使用成簇規律間隔短回文重復序列(CRISPR)系統治療丙酮酸激酶缺乏癥(PKD)。該技術提供了設計改進的單鏈向導RNA(sgRNA)的可能性，特別是與tracrRNA相關的改進的crRNA，其被并入CRISPR相關蛋白(Cas9)中，以識別和誘導特定靶位置處的DNA雙鏈斷裂。DNA雙鏈斷裂將在PKLR基因修復的供體序列存下通過同源重組(HR)進行修復。過同源重組(HR)進行修復。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】2012)。因此，使用CRISPR系統的重要挑戰是需要鑒定并最小化由這些核酸酶誘導的潛在有害的脫靶突變。盡管使用高保真Cas9顯著降低了脫靶活性(Vakulskas,Dever et al.2018)，在使用基因編輯治療患者之前，需要仔細分析治療性RNP的脫靶效應。
[0006]潛在的脫靶效應的高靈敏度分析對于任何臨床應用是強制性的，因為甚至低頻事件也可能導致有害的結果。涉及潛在脫靶的計算機預測方法最常用于預測脫靶效應。然而，這些方法不考慮潛在脫靶的基因組位置，也不考慮感興趣的細胞類型。因此，它們鑒定特異性sgRNA的脫靶位點的能力非常有限。分析基因編輯技術副作用的理想方法應當是以全基因組無偏方式且高靈敏度地識別脫靶位點的方法；也就是說，具有在非常大的細胞群中檢測甚至低頻的突變的能力。GUIDE
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seq基于雙鏈寡脫氧核苷酸(dsODN)標簽的有效整合，隨后是標簽特異性擴增和高通量測序。GUIDE
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seq是高靈敏度的，并且可檢測在細胞群中由所測試的sgRNA誘變的脫靶位點。GUIDE
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seq的一些優點包括其實驗簡單、高效和精確，以及在生理學相關的細胞環境中檢測核酸酶誘導的DSB的修復結果。CIEMAT已經通過GUIDE
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seq在HSPC自身中評估了相關sgRNA的脫靶效應，遵循最嚴格的標準來選擇基于基因編輯的治療工具。這些類型的基因編輯平臺副作用的全基因組無偏分析將保證HSPC中基因編輯的臨床應用的安全性。
[0007]附圖簡述
[0008]圖1：顯示相對于RPK起始密碼子的不同單鏈向導RNA位置的圖。部分RPK CDS標記為紫色。RPK起始密碼子的ATG顯示為綠色。RPK起始密碼子上游30bp的隱性ATG顯示為紅色。另外，基因組中除了SG1靶之外的單鏈向導RNA靶用藍色框顯示，SG1靶用紅色框顯示。
[0009]圖2：不同單鏈向導RNA識別PKLR基因座的效力。通過Surveyor法分析人細胞系K562中SG1、SG2、SG3和SG4向導的Indel(插入/缺失)頻率。純化基因組DNA，并進行PCR以擴增RPK基因起始密碼子周圍的區域。然后，根據制造商說明，利用Surveyor核酸酶S消化PCR產物，并通過10％ Novex TBE凝膠分離來評估消化的產物。分析凝膠圖像，以便通過測量不同條帶的密度測定值來測量裂解。
[0010]圖3：不同單鏈向導RNA識別PKLR基因座的Indel頻率的效力。通過TIDE法分析人CB
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CD34
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細胞中SG1、SG3、SG5、SG6和SG8的Indel頻率。純化基因組DNA，并進行PCR以擴增PKLR基因的RPK轉錄物變體起始密碼子周圍的區域。然后，對PCR產物進行Sanger測序。未編輯的細胞總是用作用TIDE計算INDEL頻率的陰性對照。最后，通過使用TIDE軟件(https://tide.deskgen.com/)計算Indel頻率來評估所設計向導的活性。
[0011]圖4：所選擇的單鏈向導RNA的脫靶分析。在用與WT
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Cas9或HiFi
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Cas9蛋白處于RNP形式的SG1向導RNA電穿孔的Jurkat細胞中進行GUIDE
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seq分析。5天后，分離基因組DNA。使用IDT內部向導分析工具，確定448個脫靶位點，其中147個出現于>1％的讀長中。來自用WT
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Cas9 RNP編輯的樣品的讀長有84％顯示特異性在靶基因編輯，并且當使用HiFi
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Cas9進行RNP形成時，該百分比增加(94％的Indel發生于在靶位點中)，表明PKLR SG1 RNP是安全有效的。
[0012]圖5：用SG1、SG9和SG10 RNP(與WT
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Cas9或HiFi
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Cas9復合)編輯的hCD34
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細胞中不同在靶位點處的HDR相比NHEJ分析。由圖4設計rhAmpSeq分析。簡言之，用rhAmpSeq池擴增來自使用PKLR SG1的GUIDE
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Seq實驗的最高命中(top Hits)(1個在靶位點ON和48個脫靶位點OT)。然后，文庫在MiSeq系統上運行并用內部分析工具進行分析。通過將NHEJ的百分比與不
完全HDR(部分HDR模板的同源重組)的百分比和完全HDR(整個HDR模板的同源重組)的百分比相加來計算切割位點處的編輯水平。SG1 RNP顯示出在靶位點處最高的基因編輯活性。使用WT
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或HiFi
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Cas9時，在完全HDR水平上未發現差異(分別為30.6％相比30.4％)，但是使用HiFi
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Cas9時，NHEJ和不完全HDR水平降低。灰色，完全HDR的百分比；橙色，不完全HDR的百分比；藍色，NHEJ的百分比。
[0013]圖6：用SG1 RNP復合物電穿孔的CB
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hCD34
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細胞中由高
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低排序的前十個位點的脫靶分析。由圖4設計rhAmpSeq分析。使用SG1單鏈向導RNA與WT
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Cas9或HiFi
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Cas9(IDT)復合形成的RNP復合物來編輯CB
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hCD34
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細胞。另外，在一些樣品中加入特異性HDR模板。用rhAmpSeq池擴增來自使用PKLR SG1的GUIDE
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Seq實驗的最高命中(1個在靶位點ON和48個脫靶位點OT)。然后，文庫在MiSeq系統上運行，并用內部分析工具進行分析。顯示前十個位點中RNP[WT
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或HiFi
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Cas9 HiFi+SG1(PKLR SG1 ATG)]±
HDR
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SG1模板的總基因編輯效率。橙色柱和黃色柱中，基因編輯由不存在特異性HDR模板時分別與WT
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Cas9或HiFi
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Cas9復合的SG1引起。藍色柱和灰色柱中，基因編輯由存在特異性HDR模板時分別與WT
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Cas9或HiFi
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Cas9復合的SG1引起。不連續的紅線指示檢測極限(<0.1％)。當使用HiFi
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Cas9時，與來自WT
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Cas9編輯的讀長(藍色柱和橙色柱)相比，脫靶讀長的數目明顯減少(灰色柱和黃色柱)。不存在HDR模板時，對應于脫靶位點的所有讀長都在檢測限以下(0.1％)，并且用SG1
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Cas9 RNP和HDR模板編輯細胞時獲得的最高脫靶得分為0.13％。
[0014]圖7：將報告基因和治療性同源供體靶向PKLR基因座的方案。設計兩個構建體在RPK轉錄物變體的基因組起始位點(RPK的起始密碼子[ATG]為紅色)進行i)報告基因供體(上面紫色部分)和ii)治療本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種分離的crRNA序列，其中所述序列包含SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:11，或者SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:11的變體，所述變體具有與SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:11至少95％的序列同一性。2.權利要求1所述的分離的crRNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO.:1組成。3.權利要求1或2中任一項所述的分離的crRNA序列，其中所述序列與tracrRNA核苷酸序列化學結合，所述tracrRNA核苷酸序列與CRISPR
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相關蛋白(Cas)多肽相互作用。4.一種單鏈向導sgRNA，其包含權利要求3所述的crRNA序列和tracrRNA序列。5.根據權利要求4所述的sgRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO.:12。6.一種核糖核蛋白(RNP)復合物，其包含權利要求1或2中任一項所述的分離的crRNA序列，或者權利要求5所述的sgRNA，以及CRISPR
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相關蛋白(Cas)多肽。7.一種CRISPR系統，其包括編碼Cas多肽的mRNA和權利要求4或5中任一項所述的sgRNA。8.權利要求6所述的RNP復合物或權利要求7所述的CRISPR系統，其中所述Cas多肽為Cas9多肽。9.權利要求6所述的RNP復合物或權利要求7所述的CRISPR系統，其中所述Cas多肽為高保真的或增強特異性的Cas9多肽變體。10.一種系統，其包括權利要求6所述的RNP復合物或權利要求7所述的CRISPR系統，以及腺相關病毒顆粒或同源供體AAV載體，所述腺相關病毒顆粒或同源供體AAV載體可遞送用于在靶細胞如原代細胞中經由同源定...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J，
申請(專利權)人：生物醫學網絡研究財團中心希門尼斯迪亞茲健康研究基金會研究所小利蘭，
類型：發明
國別省市：