一種GALNS抑制劑及其逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及細胞及分子生物學(xué)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種GALNS抑制劑及其逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法和應(yīng)用。所述GALNS抑制劑包括GALNS的shRNA質(zhì)粒、GALNS的siRNA中的至少一種。本發(fā)明專利技術(shù)通過GALNS抑制劑轉(zhuǎn)染鼻咽癌腫瘤細胞，間接上調(diào)自噬蛋白LC3的表達，促進自噬性死亡產(chǎn)生。GALNS抑制劑(GALNS的siRNA)對體外腫瘤細胞的生長有明顯抑制作用，GALNS抑制劑(GALNS的shRNA質(zhì)粒)對體內(nèi)腫瘤細胞的生長具有明顯抑制作用，進而抑制腫瘤生長。因此，本發(fā)明專利技術(shù)為抗鼻咽癌新藥的設(shè)計提供了新靶點，為抗腫瘤惡性增殖藥物的開發(fā)和制備提供了新的思路。瘤惡性增殖藥物的開發(fā)和制備提供了新的思路。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種GALNS抑制劑及其逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法和應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及細胞及分子生物學(xué)及醫(yī)藥
，具體涉及一種GALNS抑制劑及其逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法和應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]鼻咽癌是一種常見的發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤。鼻咽癌具有明顯的地理分布，中國南部和東南亞地區(qū)的鼻咽癌發(fā)病率較高。Epstein Barr病毒、環(huán)境、遺傳和飲食習(xí)慣是鼻咽癌進展的關(guān)鍵主導(dǎo)因素。放療和化療是鼻咽癌的標準治療方法，可提高早期鼻咽癌患者的10年生存率。但由于鼻咽癌早期癥狀隱蔽，治療效果差，中位生存率短，大多數(shù)患者在確診時已處于鼻咽癌晚期。因此，揭示鼻咽癌發(fā)展過程中的信號通路，選擇相應(yīng)靶點設(shè)計研發(fā)抗鼻咽癌惡性生長的藥物進行靶向治療，將對鼻咽癌的治療非常有益。
[0003]半乳糖胺
?
(n
?
乙酰基)
?6?
磺化酶(Galactosamine
?
(N
?
acetyl)
?6?
sulfatase，GALNS)基因位于染色體16q24.3上。GALNS是一種溶酶體酶，前期研究發(fā)現(xiàn)GALNS基因突變導(dǎo)致GALNS缺乏，導(dǎo)致溶酶體儲存病Morquio A的發(fā)生。自噬是一種高度保守的自我分解代謝機制，依賴于溶酶體途徑降解錯誤折疊或長壽命的蛋白質(zhì)和受損的細胞器。而自噬又被認為是細胞程序性死亡途徑之一。一般認為，自噬在腫瘤初期抑制腫瘤進展，而在腫瘤形成時可支持癌細胞存活。研究表明，溶酶體酶的紊亂是維持腫瘤發(fā)生的重要因素。所以GALNS可能參與自噬調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞惡性生長的病理過程。但是目前國內(nèi)外記載的GALNS均只可用于治療溶酶體儲積疾病，因此有必要開發(fā)一種GALNS抑制劑及其逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法和應(yīng)用，從而逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞的惡性生長。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0004]本專利技術(shù)旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本專利技術(shù)提出一種GALNS抑制劑及其逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法和應(yīng)用，從而逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞的惡性生長。
[0005]本專利技術(shù)的第一方面提供一種GALNS抑制劑。
[0006]具體的，所述GALNS抑制劑包括GALNS的shRNA質(zhì)粒、GALNS的siRNA中的至少一種。
[0007]優(yōu)選的，所述GALNS的shRNA質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]優(yōu)選的，所述GALNS的shRNA質(zhì)粒的載體為psi
?
LvRU6rLP。
[0009]優(yōu)選的，所述GALNS的siRNA包括siGALNS
?
1、siGALNS
?
2中的至少一種。
[0010]優(yōu)選的，所述siGALNS
?
1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述siGALNS
?
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]本專利技術(shù)的第二方面提供一種GALNS抑制劑逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞生長的方法。
[0012]具體的，所述方法包括以下步驟中的其中一種：
[0013](1)使用siGALNS
?
1或siGALNS
?
2對鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)染后在體外培養(yǎng)；
[0014](2)使用所述GALNS的shRNA質(zhì)粒對鼻咽癌細胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)、消化后接種于小鼠背部。
[0015]優(yōu)選的，步驟(1)中，所述體外培養(yǎng)的時間為48
?
96h。
[0016]進一步優(yōu)選的，步驟(1)中，所述體外培養(yǎng)的時間為70
?
80h。
[0017]更進一步優(yōu)選的，步驟(1)中，所述體外培養(yǎng)的時間為72h。
[0018]具體的，步驟(1)中，將200μl OPTI
?
MEM和10μl siRNA
?
Mate轉(zhuǎn)染試劑加入一支無菌EP管內(nèi)，混勻；在另外一支EP管內(nèi)加入200μl OPTI
?
MEM和150pmol待轉(zhuǎn)染的siGALNS
?
1或siGALNS
?
2,并充分混勻；室溫靜置5分鐘后，將兩個EP管內(nèi)試劑合并，混勻，再靜置20分鐘；靜置時，給6孔板換液，每孔換上2ml預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基；將靜置完畢的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入孔中。加完后將細胞培養(yǎng)基輕晃混勻。
[0019]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述GALNS的shRNA質(zhì)粒包裝在慢病毒中。
[0020]進一步優(yōu)選的，所述加入慢病毒的滴度為0.8
?
1.2
×
108TU/mL。
[0021]更進一步優(yōu)選的，所述加入慢病毒的滴度為1
×
108TU/mL。
[0022]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述接種于小鼠背部的細胞量為0.8
?
1.2
×
106個。
[0023]進一步優(yōu)選的，步驟(2)中，所述接種于小鼠背部的細胞量為1
×
106個。
[0024]具體的，步驟(2)中，GALNS的shRNA質(zhì)粒包裝在慢病毒中，CNE2和HONE1細胞培養(yǎng)在六孔板內(nèi)，加入1μl的慢病毒(滴度為1
×
108TU/ml)/孔，72小時后消化細胞，分別以1x106個細胞的接種量接種于雄性裸鼠背部，24天后取下腫瘤拍照，以無意序列(shCTL)為對照組。
[0025]本專利技術(shù)的第三方面提供一種GALNS作為藥物靶點在逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞惡性生長中的應(yīng)用。
[0026]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的有益效果如下：
[0027]本專利技術(shù)通過GALNS抑制劑轉(zhuǎn)染鼻咽癌腫瘤細胞，間接上調(diào)自噬蛋白LC3的表達，促進自噬性死亡產(chǎn)生。GALNS抑制劑(GALNS的siRNA)對體外腫瘤細胞的生長有明顯抑制作用，GALNS抑制劑(GALNS的shRNA質(zhì)粒)對體內(nèi)腫瘤細胞的生長具有明顯抑制作用，進而抑制腫瘤生長。因此，本專利技術(shù)為抗鼻咽癌新藥的設(shè)計提供了新靶點，為抗腫瘤惡性增殖藥物的開發(fā)和制備提供了新的思路。
附圖說明
[0028]圖1為本專利技術(shù)實施例1中GALNS抑制劑對體外鼻咽癌細胞生長的抑制作用的檢測結(jié)果圖；
[0029]圖2為本專利技術(shù)實施例2中GALNS抑制劑對體內(nèi)鼻咽癌細胞生長的抑制作用的檢測結(jié)果圖；
[0030]圖3為本專利技術(shù)實施例3中鼻咽癌細胞中GALNS與自噬性死亡關(guān)系檢測結(jié)果圖。
具體實施方式
[0031]為了讓本領(lǐng)域技術(shù)人員更加清楚明白本專利技術(shù)所述技術(shù)方案，現(xiàn)列舉以下實施例進行說明。需要指出的是，以下實施例對本專利技術(shù)要求的保護范圍不構(gòu)成限制作用。
[0032]以下實施例中所用的原料、試劑或裝置如無特殊說明，均可從常規(guī)商業(yè)途徑得到，或者可以通過現(xiàn)有已知方法得到。
[0033]實施例1
?
3所使用實驗材料如下：
[0034]細胞系：人鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1由本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種GALNS抑制劑，其特征在于，所述GALNS抑制劑包括GALNS的shRNA質(zhì)粒、GALNS的siRNA中的至少一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GALNS抑制劑，其特征在于，所述GALNS的shRNA質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GALNS抑制劑，其特征在于，所述GALNS的shRNA質(zhì)粒的載體為psi
?
LvRU6rLP。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GALNS抑制劑，其特征在于，所述GALNS的siRNA包括siGALNS
?
1、siGALNS
?
2中的至少一種。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的GALNS抑制劑，其特征在于，所述siGALNS
?
1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述siGALNS
?
2的核苷酸序列如SE...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張鵬，曾憲海，張進，李一圣，邱書奇，張相民，
申請(專利權(quán))人：深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院深圳市耳鼻咽喉研究所，深圳市龍崗區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：