肽核酸探針生物芯片及其表面等離子體共振的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種肽核酸探針生物芯片及其表面等離子體共振的檢測方法，本發明專利技術檢測系統的生物芯片固相載體上連接的是肽核酸（ＰＮＡ）檢測探針，肽核酸（ＰＮＡ）探針所附著的具有表面等離子體共振（ＳＰＲ）響應特性的金屬薄膜是金膜。該技術的研制成功將真正實現芯片技術的高通量、特異性、敏感性以及快速等特點。既可對病原微生物進行快速而準確的檢測和鑒定，同時該技術也可以應用到在野戰條件下由基層檢驗人員實施戰場病原體分布的調查、戰傷感染的早期診斷、生物戰劑的早期發現等方面，將會產生較好的經濟效益和社會效益。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物芯片領域及基于其的檢測方法，尤其是涉及肽核酸探針生 物芯片及其表面等離子體共振的檢測方法。
技術介紹
隨著分子生物學在醫學領域的廣泛應用，芯片技術必將成為未來臨床疾病 診斷中不可缺少的一個新內容。芯片技術是伴隨人類基因組計劃而產生的，是 近年來分子生物學及醫學診斷技術的重要逸艮，其突出特點在于高速度、高通 量、高并行性及多樣化、微型化、自動化等，已經成為當今生物醫學技術研究 的熱點，在基因診斷、藥物開發和毒性分析、病原檢測等多個領域顯示出巨大 的發展潛力和應用價值。目前，盡管芯片技術已經取得了長足的發展，得到世人的矚目，但是仍然 存在著許多的問題，而且價格昂貴，從而嚴重地制約了芯片技術的廣泛應用和 進一步發展。如在標記方法上，熒光法是目前使用最多的方法，但它的靈敏度 不高、需要避光，雜交完成后要快速檢測以免熒光淬滅，另外結果檢測需用價格極其昂貴的激光掃描儀等特殊設備；同位素標記法由于需要同位素和放射自 顯影，有使用不便，操作復雜，耗時較長、有污染的缺點。尤其是在基因芯片的檢測中，由用熒光標記會影響PCR擴增效率，同位素標記常用的如"P和"P 半衰期又太短，均不易推廣使用，而且PCR擴增既需要設計引物，又要PCR儀， 需要對各檢測對象的耙序列建立不同的擴增體系、擴增方法和擴增條件，這顯 然大大增加了工作量和工作難度。總之，芯片技術在樣品的制備、探針合成與 固定、分子的標記、^t據的讀取與分析等幾個方面仍然存在著許多難以解決的 問題。特別是技術成本昂貴、復雜、檢測靈敏度較低、重復性差、分析泛圍較 狹窄等問題限制了該技術在生物檢測中的應用。肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA)是借助計算機輔助設計的一種DM 模擬物，與DNA—樣也是由ATCG四種堿基的單體聚合而成，只是兩者的骨架 結構不同DNA是由磷酸二酯鍵連接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺鍵 連接的重復的N-2-氨乙基苷氨酸單位構成的。PNA不易被蛋白酶、核酸酶等降 解，也不與血清中蛋白結合，但可以通過ATCG四種堿基的互補配對原則和DNA 雜交結合。由于PNA的假肽骨架是電中性的，PNA與DNA或RNA間的雜交不存在靜電斥力，因而具有更強的親和性，其結合的穩定性和特異性都大大提高。雖然目前還未有以PNA作為探針用于基因或蛋白芯片檢測方面的報道，但 我們的分析認為，與傳統的DNA探針相比，PM做為核酸雜交探針在理論上可 能更具有優勢。因為傳統DNA探針只能與單鏈的DM雜交結合，我們知道PCR 產物都是雙鏈的，因此在雜交前必須通過變性過程使雙鏈的PCR產物解體為單 鏈的DNA片段，而且在雜交過程中必須保持低溫以防止產物DNA復性而影響雜 交效率，產生假陰性結果。但PNA作為探針其不僅僅可以與單鏈的DNA雜交高 效雜交，甚至還可以直接與雙鏈DNA以鏈侵襲模式結合形成穩定的 MA-PNA-DNA的三鏈復合物，因此大大增加了對DNA的檢測能力，且可降低標 本處理的復雜性，簡化前期標本的準備時間和操作過程，從而為臨床快速基因 檢測提供了可能。基于上迷理論，我們開創性地以PNA為探針，對PM與DNA、蛋白質的結合 活性，^t其做為芯片檢測的探針特性和雜交特性等系統地進行了研究，并與 現行的芯片檢測探針進行比較；在此^il上，并首次將PNA芯片引X^面等離 子體共振傳感器，對其做為檢測探針的芯片的特異性、敏感性，及實際檢測應 用的方法與特性進行了詳細的研究。表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)傳感器是近年迅 速發M來的新型光學傳感器裝置，其突出特點是可以實時(real time)、在 線(on line)地檢測生物分子之間的相互作用，而且不需要標記及純化，是 當前國際傳感器領域的研究熱點之一。其基本原理是當入射光以一定的角度經 一組光學器件一一通常為一高折射率的棱鏡上順序放置一層低折射率的耦合 層(多為金屬薄膜)耦合激發后，在金屬膜界面上發生表面等離子體共振，即 入射光與界表面的自由電子會發生相互作用，其中部分入射光波被電荷密度波 吸收，則入射光線不能發生全反射，從而導致反射光的強度大大減弱，反射角 也發生明顯的偏差，而且這種反射光的強度和角度的變化與界面上吸附的生物 物質分子數量的多少成一定的比例關系。作為探針固定的硫醇化合物表面單分子層自組裝層(Self- assembled Monolayer, SAM)技術自20世紀80年代初報道以來，由于其滿足了作為模型 界面的幾個主要要求，包括和基底的牢固結合，可控制的分子取向有序排列， 可控制的外表面性質及可控制的厚度等方面，因此很快地得到了各方的關注。 總的來說，SAM是基于g化合物與基底材料(如金、銀、鉑等)的強烈化學 結合而形成的。如在金膜表面，巰基被氧化而生成石危金化合鍵。其化學反應式 如下2Au+2RSH—2Au-SR+H2。 Au-S之間的化學鍵合力;f艮強，其鍵能高達184k J/mol，很少有其他基團可以與其竟爭，這就保證了結合的選擇性。同時，SAM的排列緊密有序，對酸、堿、離子滲透等有較強的抵抗力。應用此方法固定探 針可以使探針結合牢固，且排列有序、分布均勻。我們基于巰基與金屬表面的這種強烈化學結合的特性，在本專利技術中將巰基修飾的PNA探針與SPR設備的金 屬薄膜結合，制成PNA探針陣列的芯片，從而完成對各種把基因、蛋白的檢測。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供肽核酸(PNA )作為探針的生物芯片及其相應的SPR 檢測方法。通過本專利技術，可以繞過對樣品進行擴增，簡化樣本處理步驟，提高 檢測的靈敏度和特異性；且以光學信號作為檢測信號，既穩定，又易于檢測， 使結果檢測、分析的設備和技術大為簡化。從而可以充分利用生物芯片技術的 高通量、高敏感、高特異的特性，克服目前檢測芯片存在的主要缺點。并且為 了進一步提高芯片檢測的效率。我們還在傳統SPR傳感器的基礎上，研究開發 了一種更簡單的、易實施的、價廉的納米金屬膜的鍍制方法，自行設計編制了 相應的的信息處理和操作控制軟件，設計裝配了小型的流動樣本注入系統，及 適用于芯片預雜交、雜交及漂洗的溫控測試池，從而使該傳感器更具有了適用 于芯片檢測的高自動化及智能化。由于本專利技術研究提供的這種生物芯片及其快 速檢測的方法具有雜交、檢測設備簡單，技術穩定易于掌握，靈敏度高，重復 性好，應用范圍廣等的特性，其必將成為可廣泛應用于普通實驗室，甚至野外 環境的新一代生物芯片。本專利技術的目的是這樣實現的本專利技術檢測系統的生物芯片固相栽體上連接 的是肽核酸(PNA)檢測探針，肽核酸(PNA)探針所附著的具有表面等離子體 共振(SPR)響應特性的金屬薄膜是金膜，采用化學還原法制備納米金膠體液，在芯片片基表面直接鋪制二維的納米金膜層，應用探針的固化-自組裝單分子層 技術在納米金膜表面點制探針陣列；基于肽核酸探針生物芯片的表面等離子體 共振的檢測方法，其檢測步驟如下(1) 在芯片片M面鋪制具有等離子體共振(SPR)感應性的納米金膜(厚度 為10nm~ 150mn),在納米金膜表面點制肽核酸(PNA )探4十陣列制備芯片；(2) 處理標本，并與生物芯片上的探針進行雜交反應；(3) 利用等離子體共振(S本文檔來自技高網...

【技術保護點】
肽核酸探針生物芯片，其特征在于：檢測系統的生物芯片固相載體上連接的是肽核酸（ＰＮＡ）檢測探針。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：唐國林，趙為武，顧大勇，
申請(專利權)人：唐國林，趙為武，顧大勇，
類型：發明
國別省市：94[中國|深圳]