本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種嗜中性活性肽２（７２）（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ２（７２））作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物及其應(yīng)用，所述嗜中性活性肽２（７２）存在于人的血清和肝癌組織中，為血小板堿性蛋白（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）在胞外被胰酶酶切后，形成１１條肽鏈的其中一條，分子量為７７８９道爾頓；在原發(fā)性肝癌病人的血清和組織中嗜中性活性肽２（７２）表達(dá)明顯升高。可利用表面加強(qiáng)激光解吸電離－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定肝癌患者血清嗜中性活性肽２（７２）的含量，用免疫組化的方法檢測(cè)肝癌組織中嗜中性活性肽２（７２）的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)ＮＡＰ－２（７２）ｍＲＮＡ在肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細(xì)胞株中的表達(dá)水平，以此作為肝癌檢測(cè)的輔助指標(biāo)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
，涉及一種多肽標(biāo)志物的應(yīng)用，具體為一種嗜中 性活性肽2 (72)作為原發(fā)性肝癌血清標(biāo)志物及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
原發(fā)性肝癌(Primary h印atic carcinoma,以下簡稱肝癌)是世界上流 行最廣的惡性腫瘤之一，國際癌癥研究中心(IARC)估計(jì)，2000年全球肝癌發(fā)病 56.4萬人，肝癌死亡54.9萬人。而我國由于肝炎和肝炎轉(zhuǎn)肝硬化的病人眾多， 致使肝癌在我國的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平。與70年代比較，中國 肝癌死亡率水平有了較大幅度的增高，與世界其^k國家相比,我國肝癌死亡率位 居各國肝癌死亡率之首。原發(fā)性肝癌是一種惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差、侵 襲性強(qiáng)的惡性腫瘤。早期一般無明顯癥狀， 一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，病情大多已屆 入中、晚期。因此為降低其發(fā)病率和死亡率，諸多學(xué)者長期致力于防治肝癌的 研究。近幾十年來，肝癌的臨床診治及基礎(chǔ)研究均取得了豐碩成果，但其總體 預(yù)后并未得到顯著改善，難以明確診斷而失去手術(shù)的時(shí)機(jī)是重要的原因之一。目前圖像檢測(cè)(包括CT， MRI)、化學(xué)檢測(cè)(血清學(xué)和免疫學(xué))及細(xì)胞組織 學(xué)檢測(cè)是癌癥診斷的三大支柱。常規(guī)的肝癌診斷主要為血清AFP檢測(cè)，肝臟 B超檢查或磁共振檢查，肝動(dòng)脈造影，肝穿剌活組織檢查，外科手術(shù)活檢或冰 凍切片檢查等。其中AFP已成為最有價(jià)值的肝癌標(biāo)志物，多年以來一直作為診 斷肝癌的重要參考依據(jù)。但是30%-40%的肝癌病人的AFP陰性，常使臨床的早 期診斷遇到這兩種情況 一是APP濃度高于正常(20Pg/L)但不達(dá)到診斷肝癌的 標(biāo)準(zhǔn)(40(Htg/L)，如若影像診斷未有肝內(nèi)占位性病變發(fā)現(xiàn)，則可 被視為活動(dòng)性 肝病，長期門診隨訪，而坐失根治良機(jī)。二是AFP陰性病例，實(shí)時(shí)超聲出現(xiàn)可疑占位性病變而無法定性，對(duì)這類病人進(jìn)一步再作CT、磁共振成像、放射性核 素掃描等檢測(cè)，往往眾說紛紜，結(jié)論不一，因而延誤了肝癌的診斷。為此近年 來提倡多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)以提高肝癌檢測(cè)的靈敏度和特異度，但多項(xiàng)指標(biāo)組 合在提高肝癌診斷敏感性的同時(shí)，降低了其診斷的特異性及準(zhǔn)確性，多種標(biāo)志 物聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用也具有了一定的局限性。因此，尋找有效的腫瘤標(biāo)志物用于 癌變機(jī)理研究、藥物靶標(biāo)的設(shè)計(jì)、腫瘤的診斷及高危人群的篩査成為肝癌研究 的當(dāng)務(wù)之急。為了更快速、簡便、直接檢測(cè)在異源樣品中大量的蛋白質(zhì)，Hutchins和Yip 提出了 一種新的質(zhì)譜技術(shù)表面增強(qiáng)激光解吸/電離時(shí)間飛行質(zhì)譜 (Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)，這一技術(shù)為從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度研究腫瘤，尋 找特異、靈敏的標(biāo)志物提供了優(yōu)良的技術(shù)平臺(tái)。應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)目前已 在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等研究中成功找到多個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物，并由此 建立了一些檢測(cè)惡性腫瘤的方法。進(jìn)一步通過色譜純化，SDS-PAGE凝膠電泳， 胰酶消化，MALDI分析肽譜或MS/MS檢測(cè)出部分序列，再通過網(wǎng)上比對(duì)可鑒定 出部分蛋白標(biāo)志物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種嗜中性活性肽2 (72)在原發(fā)性肝癌檢測(cè)中的應(yīng)用。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定原發(fā)性肝癌血清標(biāo)本在7.7kDa位置蛋白 為嗜中性活性肽2(72) (Neutrophil -activating p印tide 2(72))，它存在于 人的血清和肝癌組織中，為血小板堿性蛋白(Platelet basic protein)在胞 外被胰酶酶切后，形成11條肽鏈的其中一條，分子量為7789道爾頓，由72個(gè) 氨基酸組成，在原發(fā)性肝癌病人的血清和組織中嗜中性活性肽2(72)表達(dá)明顯 升高。嗜中性活性肽2(72)在原發(fā)性肝癌檢測(cè)中的應(yīng)用，用表面加強(qiáng)激光解吸電離 一飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定肝癌患者血清嗜中性活性肽2(72)的含量，用免疫組化 的方法檢測(cè)肝癌組織中嗜中性活性肽2(72)的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) NAP-2(72)mRNA在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。利用嗜中性活性肽2 (72)對(duì)肝癌的檢測(cè)具體通過以下方案實(shí)現(xiàn)(1) 用表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定原發(fā)性肝癌患者與健康的血清標(biāo)本的7. 7-7. 9kDa位置蛋白的差異圖譜。(2) 利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定7. 7kDa位置蛋白為嗜中性活性肽 2(72)。(3) 用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證7. 7kDa位置蛋白為嗜中性活性肽 2(72)。本專利技術(shù)利用弱陽離子(WCX2)芯片檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者與健康人對(duì)照樣本， 發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌血清樣本在7. 7kDa位置蛋白表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照樣本。 選擇在SELDI檢測(cè)中7. 7kDa位置蛋白高表達(dá)的肝癌病人血清，運(yùn)用Blue 3GA 和Protein A去除血清中的白蛋白和IgG，將去除白蛋白和IgG的血清樣品與 樣品緩沖液混勻后，Tricine-SDS-PAGE電泳，將凝膠目的蛋白條帶用1.5 mm 切膠筆切下，置于離心管中，脫色后進(jìn)行膠內(nèi)酶解。將酶解好的樣品用C18反 相柱進(jìn)行分離后，直接串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜打擊條件為ESI噴霧電壓3.2 kV， ION TRAP碰撞能量35%。將質(zhì)譜檢測(cè)到的肽段的質(zhì)量和序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 SWISS-PROT/TrAEM-BL上進(jìn)行搜索比較，獲取可信的完整蛋白。確定蛋白質(zhì)一 級(jí)序列后制備相應(yīng)的多克隆抗體，并用抗體與目的蛋白高表達(dá)的樣本結(jié)合，再 用質(zhì)譜檢測(cè)以驗(yàn)證7. 7kDa位置蛋白為嗜中性活性肽2(72)。本專利技術(shù)應(yīng)用SELDI質(zhì)譜儀，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等，首次發(fā)現(xiàn)嗜中 性活性肽2(72)可用于肝癌的檢測(cè)，為原發(fā)性肝癌的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)提供了新的標(biāo) 志物，對(duì)進(jìn)一步提高目前原發(fā)性肝癌的診治水平具有一定的意義。附圖說明圖1為SELDI檢測(cè)嗜中性活性肽2(72)在肝癌中高表達(dá)，上為肝癌病人血 清，下為正常對(duì)照血清。圖2為SELDI檢測(cè)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，圖2中的①為未加抗體的肝癌血清中嗜 中性活性肽2(72)高表達(dá)，②為與相應(yīng)抗體反應(yīng)過后的血清，嗜中性活性肽2(72) 水平明顯下降。圖3為嗜中性活性肽2(72)在肝癌組織中的表達(dá)，A為肝癌組織NAP-2陽性表達(dá)，箭頭所指為陽性表達(dá)的肝癌細(xì)胞，B為癌旁組織NAP-2陰性表達(dá)。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而 不用于限制本專利技術(shù)范圍。實(shí)施例l肝癌相關(guān)血清標(biāo)志物的鑒定分離用的樣本為lml肝癌病人血清。運(yùn)用Blue 3GA和Protein A去除血清 中的白蛋白和IgG，配制Tricine-SDS-PAGE分離膠、間隙膠和濃縮膠,將去除 白蛋白和IgG的血清樣品與樣品緩沖液混勻后，煮沸5 min，上樣，使用垂直 小電泳槽進(jìn)行電泳，40V約1.5h，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至60V約1.5h， 電泳結(jié)束后，考馬斯亮染色1 h，雙蒸水洗凈膠面直到背景清晰，將凝膠目的 蛋白條帶用1.5mm切膠筆切下，置于離心管中，脫色后進(jìn)行膠內(nèi)酶解，將酶解 好的樣品用C18反相柱進(jìn)行分離后，直接高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜打擊條 件為ESI噴霧電壓3. 2 kV, ION TRAP碰撞能量35%。將質(zhì)譜檢測(cè)到的肽段本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
嗜中性活性肽２（７２）（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ２（７２）），其特征在于，它存在于人的血清和肝癌組織中，為血小板堿性蛋白（Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）在胞外被胰酶酶切后，形成１１ 條肽鏈的其中一條，由７２個(gè)氨基酸組成，分子量為７７８９道爾頓，在原發(fā)性肝癌血清和組織標(biāo)本中表達(dá)明顯升高，ＮＡＰ－２（７２）ｍＲＮＡ在肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細(xì)胞株中的表達(dá)明顯升高。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何敏，張志勇，覃健，蔣作祎，胡天橋，韋霄，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣西醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：45[]
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