一種耐熱型蛋白酶突變體及其編碼基因和應用制造技術

本發明專利技術提供了一種耐熱型蛋白酶突變體及其編碼基因和應用。本發明專利技術通過利用易錯PCR方法來構建突變體文庫，對Bacillus licheniformis WX

【技術實現步驟摘要】
一種耐熱型蛋白酶突變體及其編碼基因和應用


[0001]本專利技術屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及一種耐熱型蛋白酶突變體及其編碼基因和應用。

技術介紹

[0002]蛋白酶是催化水解蛋白質中肽鍵的一類酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，其有著許多不同的生理功能。蛋白酶是應用最多的酶制劑之一，例如食品工業、釀酒釀造、洗滌劑行業、飼料工業、制革工業、絲綢行業和醫藥行業等，所以，這種環境下對蛋白酶的產量和特性改良方面都提出了更高的要求。
[0003]目前市場上大多數蛋白酶經70℃處理后僅剩余不到20%的酶活，且總體耐溫性能差，限制了蛋白酶的廣泛使用。例如在飼料生產時，酶制劑與飼料混勻后要經過高溫造粒，在此過程中酶易變性失活。因此，提高蛋白酶的耐熱性至關重要。
[0004]易錯PCR技術是在采用DNA聚合酶進行PCR反應擴增目的片段時，通過調整反應條件，增加擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，構建突變體文庫，從而篩選需要的正向突變體。易錯PCR技術可以很好地應用于蛋白質的分子改造中。

技術實現思路

[0005]本專利技術提供了一種耐熱型蛋白酶突變體及其編碼基因和應用。本專利技術通過易錯PCR方法構建突變體文庫和定向篩選，對Bacillus licheniformis WX
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02來源的蛋白酶基因進行改良，篩選得到多種耐熱性提高的突變體，這些突變體有助于提升其在飼料、食品等領域中的應用。
[0006]為了實現上述專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案予以實現：本專利技術提供了一種耐熱型蛋白酶突變體，其具有以下的氨基酸序列之一：（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；（5）如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；（6）如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；（7）如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；（8）如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；（9）如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；（10）如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；（11）如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；（12）如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。
[0007]進一步的，所述耐熱型蛋白酶突變體具體為由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為纈氨酸獲得的BLAPR01；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸獲得的BLAPR02；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸和第180位的天冬氨酸變為甘氨酸獲得的BLAPR03；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸和第352位的天冬酰胺變為組氨酸獲得的BLAPR04；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸和第363位的絲氨酸變為脯氨酸獲得的BLAPR05；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸和第344位的天冬酰胺變為絲氨酸獲得的BLAPR06；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第247位酪氨酸變為天冬氨酸獲得的BLAPR07；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第149位纈氨酸變為甘氨酸獲得的BLAPR08；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第217位色氨酸變為纈氨酸獲得的BLAPR09；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第272位脯氨酸變為谷氨酸獲得的BLAPR10；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第214位甘氨酸變為亮氨酸獲得的BLAPR11；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第118位丙氨酸變為甲硫氨酸獲得的BLAPR12。
[0008]本專利技術還提供了所述的耐熱型蛋白酶突變體的編碼基因，其具有以下的核苷酸序列之一：（1）如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；（2）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；（3）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；（4）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；（5）如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；（6）如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列；（7）如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；（8）如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列；（9）如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列；（10）如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列；（11）如SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列；（12）如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列。
[0009]本專利技術還提供了包含所述的編碼基因的重組表達載體。
[0010]本專利技術還提供了包含所述的編碼基因的重組基因工程菌。
[0011]進一步的，所述基因工程菌為枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌或解淀粉芽孢桿菌。
[0012]本專利技術還提供了所述的耐熱型蛋白酶突變體的制備方法，包括以下步驟：（1）將耐熱型蛋白酶突變體的編碼基因連接到pUB110載體上，得到的重組表達載體轉化入感受態細胞中，利用抗性標記篩選陽性克隆，得到重組基因工程菌；（2）將所述的重組基因工程菌進行搖瓶發酵，震蕩培養，發酵產生蛋白酶突變體；（3）將搖瓶發酵后的重組基因工程菌株接種到發酵罐中擴大發酵培養，得到耐熱型蛋白酶突變體BLAPR01、BLAPR02、BLAPR03、BLAPR04、BLAPR05、BLAPR06、BLAPR07、BLAPR08、BLAPR09、BLAPR10、BLAPR11或BLAPR12。
[0013]進一步的，所述擴大發酵培養的工藝為：pH自然、溫度37~40℃、攪拌速率600~800rpm、通風量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上。
[0014]進一步的，所述擴大發酵培養的培養基的組分及重量百分比為：豆粕5
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10%、玉米粉1
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5%、PPG
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20000 0.1
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1.0%、蛋白酶0.1
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1.0%、淀粉酶0.1
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種耐熱型蛋白酶突變體，其特征在于，所述耐熱型蛋白酶突變體具有以下的氨基酸序列之一：（1）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；（2）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；（3）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；（4）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；（5）如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；（6）如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；（7）如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；（8）如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；（9）如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；（10）如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；（11）如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；（12）如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。2.根據權利要求1所述的耐熱型蛋白酶突變體，其特征在于，所述耐熱型蛋白酶突變體具體為由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為纈氨酸獲得的BLAPR01；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸獲得的BLAPR02；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸和第180位的天冬氨酸變為甘氨酸獲得的BLAPR03；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸和第352位的天冬酰胺變為組氨酸獲得的BLAPR04；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸和第363位的絲氨酸變為脯氨酸獲得的BLAPR05；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸和第344位的天冬酰胺變為絲氨酸獲得的BLAPR06；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第247位酪氨酸變為天冬氨酸獲得的BLAPR07；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第149位纈氨酸變為甘氨酸獲得的BLAPR08；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第217位色氨酸變為纈氨酸獲得的BLAPR09；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第272位脯氨酸變為谷氨酸獲得的BLAPR10；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的第127位的賴氨酸變為精氨酸、第216位的谷氨酸變為天冬氨酸、第344位的天冬酰胺變為絲氨酸和第214位甘氨酸變為亮氨酸獲得的BLAPR11；由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白酶的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：方安然，孫建飛，付五兵，肖志壯，
申請(專利權)人：青島根源生物技術集團有限公司，
類型：發明
國別省市：