一種刺激皮膚類器官分泌外泌體的方法技術

本發明專利技術屬于細胞生物學領域，具體涉及一種刺激皮膚類器官分泌外泌體的方法。本發明專利技術方法對皮膚類器官施以1

【技術實現步驟摘要】
一種刺激皮膚類器官分泌外泌體的方法


[0001]本專利技術屬于細胞生物學領域，具體涉及一種刺激皮膚類器官分泌外泌體的方法。

技術介紹

[0002]生命的進展過程中，皮膚的物理變化是體現機體老化的首要觀察結果。長久以來，人們致力于通過各種抗衰老方法來改善皮膚的質量。通常認為，皮膚的老化是由外在因素(環境方面包括紫外線照射、空氣污染、吸煙或營養缺乏)和內在因素(例如細胞老化和荷爾蒙變化)共同決定的，這些因素都會導致皮膚功能和再生潛力的喪失。特別是，內在皮膚老化是一個隨年齡增加而不可避免的加劇的過程，其主要因素包括活性氧(ROS)的形成(加速皮膚老化，水分流失)、端粒磨損加速或基質金屬蛋白酶(MMP)表達增加(結構完整性喪失，拉伸強度和彈性下降)，這些因素都會導致皮膚形態發生變化。此外，炎癥性皮膚疾病和難愈合傷口，也是一直困擾人們的皮膚缺陷問題。
[0003]對于上述皮膚衰老或缺陷問題，目前采用的改善策略包括使用化學、生物或物理手段的局部非侵入性和侵入性策略。非侵入性策略主要以化妝品、化學換膚和光療的方式出現。從功效方面看，以抗氧化劑和細胞調節劑為主的化妝品可用于增強皮膚對ROS引起的氧化應激保護。激光治療策略能夠產生膠原蛋白和彈性蛋白、重塑真皮以及減少色素和紅斑等，但并不是每個人的皮膚都適用，相當多的人會產生強烈的副作用。在侵入性策略中，微針療法用于將藥物跳過皮膚屏障直接輸送到真皮層中，與非侵入性策略相比，具有更直接的效果，但持續時間較短，而且會一定程度造成皮膚受損，甚至會引起皮膚炎癥。此外，2000年初興起的干細胞療法也曾廣泛應用于皮膚治療。然而，干細胞治療的安全性和有效性一直存在爭議，一些研究表明干細胞本身并不參與治療過程且注入缺陷部位的干細胞顯示出低細胞活力。因此，目前的主流皮膚抗衰策略或多或少都會存在一些安全性和有效性的問題，并不適用于每一個人。因此，開發個體化的皮膚質量改善策略是未來皮膚護理的一大趨勢。
[0004]外泌體是細胞分泌的直徑30～150nm的雙層磷脂囊泡，其攜帶包括脂質、蛋白質和核酸在內的多種生物分子。外泌體可以由大多數類型的細胞分泌，但不同細胞分泌的外泌體中攜帶的生物分子成分有所不同，且不同的細胞分泌的外泌體的量也是不同的。最近的研究表明外泌體在改善皮膚缺陷(如老化、特應性皮炎和傷口)和修復屏障敏感中具有一定的功效。與干細胞治療相比，外泌體治療不是直接用異體細胞來取代自體細胞從而發揮治療效果，僅是提高和促進原本細胞的功能的和自我修復能力，主要優勢是接受者的排斥風險最小。因此使用外泌體可以避免由于細胞成分引起的生物學上的一些風險以及倫理問題。
[0005]目前在皮膚護理領域展開研究的外泌體主要是來自人類多能誘導干細胞(IPSC)、骨髓間充質干細胞(MSC)和人真皮成纖維細胞(HDF)，其都是單一細胞類型分泌的外泌體，由于不同細胞分泌的外泌體中攜帶的生物分子成分有所不同，因此并沒有真正實現精準化、個體化皮膚護理。此外，外泌體的濃度和量也會對皮膚護理的效果產生很大的差異。由
于皮膚是由多種類細胞組成的高度復雜的器官，因此單一細胞類型產生的外泌體成分相較完整皮膚分泌的具有很大的差異，而人體的真正皮膚組織目前還不能在體外長期培養以分泌外泌體，這會涉及到倫理學方面的問題。
[0006]綜上所述，有必要提出一種新的外泌體制備策略，用于緩解現有技術中存在的問題。

技術實現思路

[0007]有鑒于此，本專利技術的目的旨在提供一種促進皮膚類器官分泌外泌體的方法，具體技術方案如下。
[0008]一種刺激皮膚類器官分泌外泌體的方法，所述方法使用物理
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生理聯用刺激皮膚類器官分泌出外泌體，具體步驟如下：
[0009]步驟1：制備皮膚類器官；
[0010]步驟2：將制備好的皮膚類器官解離為30
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50μm尺寸大小(以增大皮膚類器官的表面積)；
[0011]步驟3：對步驟2中解離的皮膚類器官施以1
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3輪的物理
?
生理聯用刺激，所述物理
?
生理聯用刺激為采用物理手段和生理手段協同聯用，所述物理手段包括機械刺激和動態培養，所述生理手段為饑餓刺激；每輪的所述物理
?
生理聯用刺激操作依次為饑餓刺激2天、機械刺激2天和動態培養3天；
[0012]步驟4：收集步驟3中經過1
?
3輪物理
?
生理聯用刺激操作后的培養上清液，用差速離心結合超高速離心的方式收集所述上清液中的外泌體。
[0013]進一步，所述機械刺激為將皮膚類器官置于壓力環境下培養；所述饑餓刺激為將皮膚類器官置于無糖基礎培養基上培養；所述動態培養為將皮膚類器官置于搖動環境下培養。
[0014]進一步，所述機械刺激為將皮膚類器官置于15
?
40kpa/300mmHg的壓力環境下培養。
[0015]進一步，所述無糖基礎培養基包括無糖DMEN培養基、無糖DMEM/F12培養基或SILAC Advanced DMEM/F
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12Flex培養基。
[0016]進一步，所述動態培養為將皮膚類器官置于動態搖床上以30
?
50rpm搖動培養。
[0017]進一步，對所述步驟3中的皮膚類器官進行一共3輪的物理
?
生理聯用刺激。
[0018]進一步，所述皮膚類器官包括人源組織來源的皮膚類器官和鼠源組織來源的皮膚類器官。
[0019]進一步，所述人源組織來源的皮膚類器由人體全層皮膚組織消化后具有干性的細胞培養，所述具有干性的細胞包括真皮成纖維細胞和表皮角質形成細胞，其比例為9:1～1:1(包括9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1)。
[0020]進一步，所述所述人源組織來源的皮膚類器的培養基包括Advanced DMEM/F12、5％
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10％血小板裂解物(hpL)、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、1％N2(N2補充劑)、1％B27(B27添加劑)、10Mm HEPES(4
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羥乙基哌嗪乙磺酸)、1％GlutaMAX(L
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丙氨酰
?
L
?
谷氨酰胺)、1％青霉素/鏈霉素(P/S)、1mM N
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Acetyl
?
L
?
cysteine(N
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乙酰
?
L
?
半胱氨酸)、1uM A83
?
01(TGF
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βI型受體抑制劑)、10uM Forskolin(毛喉素)、50ng/mL EGF(表皮生長因子)、100ng/mL FGF
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10
(成纖維細胞生長因子10)、100ng/mL Noggin(BMP骨形態發生蛋白的內源性抑制劑)、250ng/mL R
?
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種刺激皮膚類器官分泌外泌體的方法，其特征在于，所述方法使用物理
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生理聯用刺激皮膚類器官分泌出外泌體，具體步驟如下：步驟1：制備皮膚類器官；步驟2：將制備好的皮膚類器官解離為30
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50μm尺寸大小；步驟3：對步驟2中解離的皮膚類器官施以1
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3輪的物理
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生理聯用刺激，所述物理
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生理聯用刺激為采用物理手段和生理手段協同聯用，所述物理手段包括機械刺激和動態培養，所述生理手段為饑餓刺激；每輪的所述物理
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生理聯用刺激操作依次為饑餓刺激2天、機械刺激2天和動態培養3天；步驟4：收集步驟3中經過1
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3輪物理
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生理聯用刺激操作后的培養上清液，用差速離心結合超高速離心的方式收集所述上清液中的外泌體。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述機械刺激為將皮膚類器官置于壓力環境下培養；所述饑餓刺激為將皮膚類器官置于無糖基礎培養基上培養；所述動態培養為將皮膚類器官置于搖動環境下培養。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述機械刺激為將皮膚類器官置于15
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40kpa/300mmHg的壓力環境下培養。4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述無糖基礎培養基包括無糖DMEN培養基、無糖DMEM/F12培養基或SILAC AdvancedDMEM/F
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12Flex培養基。5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述動態培養為將皮膚類器官置于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王嘉，陸政昊，李勝，劉虹余，楊云旭，何春花，龔劉萍，
申請(專利權)人：廣州精科生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：