基于基因甲基化，蛋白，和/或miRNA標記的早期肝癌診斷制造技術

一種用于肝癌早篩的基因甲基化標記、蛋白標記、和/或miRNA聯合標記檢測方法以及相應的用于肝癌檢測的試劑盒。其檢測的甲基化基因包括選自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一個或多個基因，檢測的miRNA包括選自hsa

【技術實現步驟摘要】
基于基因甲基化，蛋白，和/或miRNA標記的早期肝癌診斷


[0001]本專利技術涉及一種基于基因甲基化標記、蛋白標記、和/或miRNA標記的肝癌檢測方法，以及相應的用于肝癌檢測的試劑盒，可用于肝癌的篩查。
[0002]相關申請的交叉引用
[0003]本申請要求2022年4月22日提交的中國專利申請號202210432017.9，2022年2月11日提交的中國專利申請號202210128906.6，2022年2月11日提交的中國專利申請號202210129809.9，2022年2月10日提交的中國專利申請號202210124651.6，2022年2月25日提交的中國專利申請號202210178482.4，2022年4月22日提交的中國專利申請號202210431016.2，以及2022年4月22日提交的中國專利申請號202210438932.9的優先權，各個專利申請的內容以全文引用的方式并入本文中。

技術介紹

[0004]肝癌在我國是發病率和死亡率均很高的癌癥之一。國家癌癥中心最新統計結果顯示，2016年中國肝細胞癌(簡稱肝癌)發病數約38.9萬，在所有癌種中排列第四位；而肝癌死亡數約33.6萬，居我國惡性腫瘤死亡第二位。目前在國內，肝癌篩查的主要方法仍然是血清甲胎蛋白(AFP)聯合超聲影像檢測。但AFP診斷早期肝癌的靈敏度只有45.3％～62％，具有約20％的假陽性率和約40％的假陰性率，故其性能并不夠理想。腹部超聲(US)影像對早期肝癌的診斷靈敏度較低(32％～63％)，也容易受到儀器性能、人為操作及醫師主觀判斷的影響。對于肝癌患者而言，早期被發現的肝癌患者，其治療和預后效果遠優于進展期肝癌患者。我國肝癌患者的五年生存率較低，只有14.1％，其中的一個主要原因是我國肝癌的早期確診率低，超過70％的患者在確診時已經為中期或晚期，而晚期肝癌的治療效果和預后均較差。因此，尋找新的肝癌標志物組合，并據此建立一套準確、便捷且經濟的肝癌早期診斷方法便具有重要的價值和意義。
[0005]近年來，基于循環腫瘤細胞(CTC)、循環腫瘤DNA(ctDNA)、游離RNA(cfRNA)以及外泌體檢測的液體活檢技術逐漸應用于癌癥輔助診斷和早篩。而國內外也有多家企業開發了基于多種類型靶標組合的癌癥早篩早診產品及服務。美國的Exact Sciences開發了一套包含3
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5個DNA甲基化標志物與AFP、AFP
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L3蛋白標志物的聯合檢測技術，用于肝癌早期診斷；該公司收購的Thrive企業曾聯合DNA突變和蛋白檢測方法，進行多種癌癥的篩查；我國的泛生子則聯合DNA突變、DNA甲基化和蛋白標志物進行肝癌檢測。
[0006]DNA異常甲基化在腫瘤發生的早期就可出現，且伴隨著腫瘤發展與轉移而出現異常甲基化程度增加。DNA異常甲基化能引起基因表達量改變，從而通過影響細胞分裂、代謝及胞間連接來促進或抑制腫瘤發生及轉移。因此，DNA甲基化檢測可以用于肝癌的早期診斷。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一種單鏈的、長度較短的內源性非編碼RNA，在轉錄后水平調控目的基因表達。miRNA廣泛參與癌細胞增殖、代謝、分化侵襲及遷移，且與多種癌癥發生發展及預后關系密切。另外，肝癌蛋白標志物也可被采用作為作為肝癌新標志物。綜上，越來越多的研究報道發現了DNA甲基化、miRNA、或蛋白標志物能有效用于腫瘤的早篩早
診。而在此基礎上，開發一種基于DNA甲基化、miRNA及蛋白標志物檢測的方法和產品，將有望進一步提高肝癌早篩早診的臨床性能，并有效用于臨床產業轉化。

技術實現思路

[0007]具體地，本專利技術通過如下各項技術方案解決現有技術中存在的技術問題。
[0008]本專利技術的一方面，提供了一種用于肝癌檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含選自基因核酸甲基化檢測試劑、蛋白檢測試劑、和/或miRNA檢測試劑的一種或多種試劑。在一些實施例中，所述試劑盒包含基因核酸甲基化檢測試劑、蛋白檢測試劑、和miRNA檢測試劑。
[0009]在一些實施例中，所述試劑盒包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含選自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一個，兩個，三個，或全部四個基因。在一些實施例中，所述試劑盒包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含選自CDKL2、USP44、和ZNF783的一個或多個基因。在一些實施例中，所述試劑盒包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含選自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少兩個基因。在一些實施例中，所述試劑盒包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三個基因。
[0010]在一些實施例中，所述試劑盒用B2M基因作為核酸甲基化的內參，并選取不含GpG位點的B2M片段作為目的序列。
[0011]在一些實施例中，所述CDKL2基因甲基化檢測試劑所檢測的甲基化序列區段包含與SEQ ID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些實施例中，所述CDKL2基因甲基化檢測試劑包含選自SEQ ID NO:57
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59的正向引物，選自SEQ ID NO:60
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62的反向引物，和選自SEQ ID NO:63
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65的探針。
[0012]在一些實施例中，所述USP44基因甲基化檢測試劑所檢測的甲基化序列區段包含與SEQ ID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些實施例中，所述USP44基因甲基化檢測試劑包含選自SEQ ID NO:71
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73的正向引物，選自SEQ ID NO:74
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76的反向引物，和選自SEQ ID NO:77
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79的探針。
[0013]在一些實施例中，所述ZNF783基因甲基化檢測試劑所檢測的甲基化序列區段包含與SEQ ID NO:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些實施例中，所述ZNF783基因甲基化檢測試劑包含選自SEQ ID NO:85
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87的正向引物，選自SEQ ID NO:88
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90的反向引物，和選自SEQ ID NO:91
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93的探針。
[0014]在一些實施例中，所述F12基因甲基化檢測試劑所檢測的甲基化序列區段包含與SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些實施例中，所述F12基因甲基化檢測試劑包含選自SEQ ID NO:100
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種用于肝癌檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含選自基因核酸甲基化檢測試劑、蛋白檢測試劑、和/或miRNA檢測試劑的一種或多種試劑。2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含基因核酸甲基化檢測試劑、蛋白檢測試劑、和miRNA檢測試劑。3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含選自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一個，兩個，三個，或全部四個基因。4.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含選自CDKL2、USP44、和ZNF783的一個或多個基因。5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含選自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少兩個基因。6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化檢測試劑，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三個基因。7.根據權利要求1
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6任一項所述的試劑盒，其特征在于，用B2M基因作為核酸甲基化的內參...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李德強，李存耀，張建勛，李鋮，黃龍妹，呂寧，陳一友，
申請(專利權)人：杭州諾輝健康科技有限公司，
類型：發明
國別省市：