細(xì)菌蛋白載體和綴合方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及多糖綴合物，其包含以下或由以下組成：與載體多肽綴合的一種或多種多糖，其中所述載體多肽選自：(a)化膿性鏈球菌SpyAD(Spy0269，GAS40)、化膿性鏈球菌SpyCEP(Spy0416，GAS57)或化膿性鏈球菌SLO(Spy0167，GAS25)；(b)CRM

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】細(xì)菌蛋白載體和綴合方法
專利

[0001]本專利技術(shù)涉及來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A群鏈球菌)的抗原用作載體蛋白的用途，連同改進(jìn)的綴合方法以及所述綴合物用于預(yù)防和/或治療疾病的用途。
[0002]專利技術(shù)背景
[0003]A群鏈球菌(GAS)引起多種疾病，從淺表感染(咽炎、皮膚感染、蜂窩組織炎)到嚴(yán)重的侵襲性疾病(產(chǎn)后敗血癥、壞死性筋膜炎、鏈球菌中毒性休克綜合征)，其中在低收入和中等收入國家(LMIC)中具有高頻的嚴(yán)重后遺癥(急性風(fēng)濕熱、ARF；風(fēng)濕性心臟病、RHD和腎小球腎炎)[1]。
[0004]咽炎是全世界兒童中最常見的癥狀性GAS感染，估計每年有超過4億例[2]并且是抗生素使用的重要驅(qū)動因素[3]，其最終可能導(dǎo)致抗生素抗性增加，這是一場日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)[4]。咽炎可能導(dǎo)致RHD，一種慢性炎性心臟瓣膜病況，其代表GAS的主要全球負(fù)擔(dān)。在2015年，估計31.9萬人死于RHD，其中RHD病例超過3300萬且損失1000萬傷殘調(diào)整生命年(DALY)[5]。接種疫苗是長期減少全球GAS相關(guān)疾病負(fù)擔(dān)的最實(shí)用策略。然而，目前還沒有針對這種病原體的商業(yè)疫苗[6]。
[0005]A群碳水化合物(GAC)是一種表面多糖，其由聚鼠李糖骨架與側(cè)鏈上交替的N
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乙酰葡糖胺(GlcNAc)構(gòu)成。它代表了一種有吸引力的疫苗候選物，因?yàn)樗叨缺Ｊ夭⒃贕AS菌株中表達(dá)。實(shí)際上，疫苗策略開發(fā)的主要障礙之一由與其他非碳水化合物抗原相關(guān)的GAS血清型多樣性代表[7]。<br/>[0006]多糖(PS)與適當(dāng)?shù)妮d體蛋白的綴合是提高其免疫原性的常用程序[8]。PS是典型的T
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細(xì)胞非依賴性抗原，其天然僅含有B
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細(xì)胞表位且缺乏T
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細(xì)胞表位。與作為T
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細(xì)胞表位的來源的蛋白的共價綴合將PS轉(zhuǎn)化為T
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依賴性抗原，其在嬰兒中具有增強(qiáng)的記憶應(yīng)答、類別轉(zhuǎn)換和抗體產(chǎn)生[9，10]。
[0007]已經(jīng)報道，人抗GAC血清成功促進(jìn)了幾種GAS菌株的吞噬作用[11]，而用與破傷風(fēng)類毒素(TT)或CRM
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載體蛋白綴合的GAC免疫的小鼠被保護(hù)免于GAS攻擊[12，13]。此外，高抗GAC抗體滴度和墨西哥兒童喉嚨中GAS的存在之間的反比關(guān)系得到證明[13]。
[0008]保守蛋白抗原也在針對GAS的疫苗開發(fā)中。具體而言，通過反向疫苗學(xué)方法，鏈球菌溶血素O(SLO)、SpyAD和SpyCEP被鑒定為有前途的疫苗候選物[14]。SLO通過防止細(xì)菌內(nèi)化至溶酶體中已被顯示為GAS的關(guān)鍵毒力因子，在溶酶體中細(xì)菌可以被破壞[15]。此外，SLO促進(jìn)GAS對中性粒細(xì)胞的吞噬清除的抵抗力，促進(jìn)GAS從先天免疫殺傷中逃逸，并且滅活的SLO表明在小鼠模型中針對GAS攻擊是保護(hù)性的[16]。SpyAD是一種表面
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暴露的粘附素，其介導(dǎo)GAS與宿主細(xì)胞的相互作用。此外，GAS菌株中SpyAD基因的缺失導(dǎo)致敲除突變體正確分裂的能力受損，表明在細(xì)菌分裂中也具有重要作用[17]。最后，SpyCEP是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白酶，具有負(fù)責(zé)白介素(IL)
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8和其他趨化因子切割的催化結(jié)構(gòu)域。IL
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8的切割代表了一種免疫逃避機(jī)制，防止IL
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8C
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末端介導(dǎo)的內(nèi)皮易位和隨后的中性粒細(xì)胞的募集[18，19]。
[0009]這三種蛋白抗原在臨床收集物中高度保守和普遍，并且與GAC一起幾乎可以覆蓋所有GAS臨床分離株[20]。因此，已經(jīng)提出由重組SLO、SpyAD和SpyCEP與GAC
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CRM
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綴合物構(gòu)
成的多組分疫苗的制劑[6]。
[0010]由于GAS的嚴(yán)重后遺癥主要影響LMIC，因此需要盡可能降低生產(chǎn)成本，以使疫苗在經(jīng)濟(jì)上可行。
[0011]專利技術(shù)詳述
[0012]在這里，測試了使用具有用于GAC的抗原和載體的雙重作用的GAS蛋白之一的可能性，旨在降低最終疫苗制劑的復(fù)雜性。CRM
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是目前用于許可的針對細(xì)菌感染的糖綴合物疫苗中的少數(shù)載體蛋白之一。出于該原因，人們越來越擔(dān)心預(yù)暴露或共同暴露于該載體可能導(dǎo)致免疫干擾和抗碳水化合物免疫應(yīng)答的減少[9]，因此驅(qū)動鑒定替代載體蛋白的需要[21，22]。本專利技術(shù)人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)SLO、SpyAD和SpyCEP各自都可用作PS的載體蛋白。
[0013]PS與載體蛋白的化學(xué)綴合是一個復(fù)雜的過程，如果不在穩(wěn)健的條件下進(jìn)行，其可能導(dǎo)致缺乏重現(xiàn)性和一致性。盡管CRM
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是眾所周知的具有完全確立綴合條件的載體蛋白，但本專利技術(shù)人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(DoE)方法，可以改進(jìn)PS(諸如GAC)與CRM
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和GAS抗原的連接的穩(wěn)健性和產(chǎn)率。
[0014]因此，本專利技術(shù)的第一個方面提供了多糖綴合物，其包含以下或由以下組成：與載體多肽綴合的一種或多種多糖，其中所述載體多肽為：
[0015](a)化膿性鏈球菌SpyAD(Spy0269，GAS40)、化膿性鏈球菌SpyCEP(Spy0416，GAS57)或化膿性鏈球菌SLO(Spy0167，GAS25)；
[0016](b)CRM
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；或
[0017](c)(a)或(b)的片段、變體和/或融合體。
[0018]通過使用GAS抗原作為載體蛋白，提供了CRM
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的替代物，消除了預(yù)先暴露或共同暴露于該載體可能導(dǎo)致免疫干擾和抗碳水化合物免疫應(yīng)答降低的擔(dān)憂。此外，使用GAS抗原作為載體多肽可能允許從提出的重組SLO、SpyAD和SpyCEP與GAC
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CRM
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綴合物的多組分疫苗制劑中除去CRM
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。這種簡化將降低生產(chǎn)成本，使疫苗在經(jīng)濟(jì)上更可行，尤其是在利潤空間較低的LMIC中。如果CRM
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保留在疫苗制劑中，則目前公開的綴合方法提供的增加的產(chǎn)率和穩(wěn)健性將有助于降低生產(chǎn)成本，并因此提高LMIC中的商業(yè)可行性。
[0019]因此，在一個實(shí)施方案中，多糖綴合物是根據(jù)本專利技術(shù)的第十個方面的方法產(chǎn)生的(如下所述)。
[0020]可替代地或另外地，所述載體多肽為：
[0021](a)選自化膿性鏈球菌SpyAD(Spy0269，GAS40)、化膿性鏈球菌SpyCEP(Spy0416，GAS57)和化膿性鏈球菌SLO(Spy0167，GAS25)，或
[0022](b)(a)的變體、片段和/或融合體。
[0023]“與載體多肽綴合的一種或多種多糖”意指或包括(a)一種或多種多糖分子可以與載體多肽綴合；和/或(b)一種或多種分子種類的多糖可以與載體多肽(例如，相同屬、種或菌株的不同多糖，或來自不同屬、種或菌株的多糖)綴合。
[0024]“SpyAD(Spy02本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.氧化多糖的方法，所述方法包括氧化所述多糖的步驟，其包括以下步驟：I.通過如下氧化所述多糖：使所述多糖與i.氧化劑，ii在合適的緩沖液中，iii.在合適的溫度下，iv.反應(yīng)合適的時間。2.氧化多糖的方法，所述方法包括以下步驟：I.通過如下氧化多糖：i.使多糖，例如，濃度為0.1
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100mg/ml，例如，0.5
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50、0.5
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25、1
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10、2.5
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7.5、4
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6或5mg/mL的多糖，與ii.濃度為0.5
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10M的氧化劑(例如，NaIO4[高碘酸鈉+、KMnO4[高錳酸鉀]、高碘酸[HIO4]或四乙酸鉛[Pb(OAc)4])，iii.在合適的緩沖液(例如，200mM磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液)pH 3
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9，例如，pH 5
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8(例如，pH 5或pH 8)中，iv.在合適的溫度(例如，20
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30℃，諸如25℃)下，v.反應(yīng)合適的時間(例如，15分鐘
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5小時，諸如，30分鐘
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3小時、30分鐘
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1小時或30分鐘)；II.(任選地)通過如下淬滅殘余的NaIO4：vi.添加合適量的還原劑，例如，Na2SO3(亞硫酸鈉)，例如相對于步驟I(ii)中NaIO4的濃度摩爾過量，例如步驟I(ii)中的NaIO4濃度的5
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10倍，或16mM，vii.在合適的溫度(例如，20
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30℃、室溫或25℃)下，viii.持續(xù)合適的時間(例如，10
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30分鐘或15分鐘)；III.(任選地)純化和/或濃縮氧化的多糖，例如，使用選自凍干、離心蒸發(fā)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和切向流過濾的方法。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所使用的多糖濃度、氧化劑、氧化劑濃度、合適的緩沖液、合適的溫度和合適的時間中的至少一種確保所述方法實(shí)現(xiàn)所述多糖的至少5％、至少10％、至少15％、10％和30％之間、10％和25％之間或約15％的氧化。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述多糖是GAC且所述方法中使用的多糖濃度、氧化劑、氧化劑濃度、合適的緩沖液、合適的溫度和合適的時間中的至少一種確保所述方法實(shí)現(xiàn)至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、60％和100％之間、65％和100％之間、70％和90％之間或75％和90％之間的GAC回收率。5.綴合氧化的多糖的方法，所述方法包括以下步驟：a.使氧化的多糖與；b.載體多肽/蛋白；和c.氰基硼氫化鈉；d.在硼酸鹽緩沖液中；e.在合適的溫度下；f.反應(yīng)合適的時間。6.綴合氧化的多糖的方法，所述方法包括以下步驟：
A.a.使?jié)舛葹?
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75mg/mL(例如，40mg/mL)的氧化的多糖與；b.濃度為5
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75mg/mL(例如40mg/mL)的蛋白；和c.濃度為0.5
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10.0mg/ml的NaBH3CN(氰基硼氫化鈉)；d.在pH 7
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9、例如pH 7.5
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8.5、pH8的硼酸鹽緩沖液中；e.在合適的溫度(例如，17.5
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42.5℃、室溫、25℃、30℃或37℃)下，f.反應(yīng)合適的時間(例如，1小時、2小時、4小時、6小時、0.5至3天、1天或2天；B.(任選地)通過如下淬滅氧化的多糖的殘余醛：j.添加合適量的NaBH4(例如，NaBH4：多糖比[w/w]為0.5∶1，或例如相對于生成的醛基或氧化的多糖的摩爾數(shù)摩爾過量，例如，5
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10倍、50倍、100倍或1000倍)，k.在合適的溫度(例如，20
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30℃、25℃或室溫)下，l.持續(xù)合適的時間(例如，1至12小時、2
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4小時)。C.(任選地)通過切向流過濾(TFF)和/或無菌過濾(例如，TFF，隨后無菌過濾)純化由步驟(B)產(chǎn)生的多糖綴合物。7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述方法中使用的氧化的多糖濃度、載體多肽/蛋白濃度、氰基硼氫化鈉濃度、硼酸鹽緩沖液的pH和合適的溫度中的至少一種確保所述方法實(shí)現(xiàn)至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.4、0.25和1之間、0.3和0.8之間或0.4和0.8之間的多糖...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：F，
申請(專利權(quán))人：葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：