使用限制性酶和高通量測序檢測DNA樣品中的甲基化改變制造技術(shù)

提供了用于DNA樣品的遺傳譜分析和表觀遺傳譜分析以及檢測DNA樣品中的遺傳改變和表觀遺傳改變的方法和系統(tǒng)，所述方法和系統(tǒng)包括用甲基化敏感的限制性酶消化DNA及隨后的高通量測序和序列讀段分析。有利地，本發(fā)明專利技術(shù)的方法和系統(tǒng)靈敏且準(zhǔn)確，并且能夠處理非常低量的DNA并且基于來自單次運行的測序數(shù)據(jù)接收大量信息，包括甲基化數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)等。突變數(shù)據(jù)等。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】使用限制性酶和高通量測序檢測DNA樣品中的甲基化改變
專利

[0001]本專利技術(shù)涉及用于對DNA樣品特別是從生物流體諸如血漿和尿液獲得的無細(xì)胞DNA樣品的遺傳特征和表觀遺傳特征進(jìn)行譜分析的方法和系統(tǒng)。本專利技術(shù)的方法和系統(tǒng)包括用甲基化敏感的或甲基化依賴的限制性酶消化DNA、制備測序文庫、高通量測序(例如，下一代測序)和序列讀段分析。有利地，本專利技術(shù)的方法和系統(tǒng)靈敏且準(zhǔn)確，并且能夠處理非常低量的DNA并且基于來自單次運行的測序數(shù)據(jù)接收大量信息，包括甲基化數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)等。本專利技術(shù)的方法和系統(tǒng)可用于例如新甲基化標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和臨床診斷應(yīng)用兩者。
[0002]專利技術(shù)背景
[0003]已知遺傳改變和表觀遺傳改變發(fā)生在許多類型的癌癥中，所述遺傳改變和表觀遺傳改變包括突變、DNA甲基化改變(例如，孤立的CpG的低甲基化和主要發(fā)生在CpG島的高甲基化)、拷貝數(shù)變異等。例如，導(dǎo)致基因沉默的腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域中CpG島的高甲基化已被廣泛研究并且在許多不同類型的癌癥中得到證實。
[0004]腫瘤將DNA片段或“無細(xì)胞DNA”釋放到體液中，并且因此可以在從體液諸如血漿和尿液獲得的“液體活檢”中檢測到腫瘤來源的DNA分子的遺傳改變和表觀遺傳改變。與傳統(tǒng)活檢相比，液體活檢是非侵入性的，并且可以更好地代表腫瘤亞克隆的全部遺傳譜。因此，在液體活檢中檢測與癌癥相關(guān)的遺傳改變和表觀遺傳改變?yōu)樵缙跈z測、預(yù)后和治療監(jiān)測帶來了巨大的希望。然而，為了檢測液體活檢中腫瘤來源的DNA，需要超靈敏的生化方法，因為生物流體中無細(xì)胞DNA的濃度可能是低的，并且此外，因為相對于正常DNA的大背景，腫瘤DNA可能以極低的量存在。
[0005]已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于檢測液體活檢中甲基化DNA分子的技術(shù)，所述技術(shù)基于亞硫酸氫鈉處理DNA以將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，隨后對轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行定量PCR或測序以檢測甲基化改變。轉(zhuǎn)化的堿基在測序數(shù)據(jù)中(PCR之后)被鑒定為胸腺嘧啶，并且可以使用讀段計數(shù)確定甲基化胞嘧啶的百分比(％)。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測序可以用靶向方法或用全基因組亞硫酸氫鹽測序來完成。高通量測序，諸如下一代測序(NGS)的進(jìn)展，允許全基因組分析和在單核苷酸水平上鑒定和分析甲基化模式的靶向方法兩者。
[0006]盡管它很受歡迎，但通過亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化DNA是繁瑣的測定，其缺點包括模板DNA的降解，向測定引入噪聲的非特異性或不完全轉(zhuǎn)化，以及基因組的復(fù)雜性從4堿基基因組降低至大約3堿基基因組，這引起PCR的特異性減少、DNA擴增的偏倚增加以及DNA測序中噪聲水平增加。此外，由于亞硫酸氫鹽處理改變了DNA的序列，突變分析受到阻礙，因為序列的改變遮蔽了其中一條DNA鏈上的轉(zhuǎn)變事件。
[0007]Ball等人(2009)Nat Biotechnol.,27(4):361
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368，報道了利用下一代測序技術(shù)進(jìn)行胞嘧啶甲基化譜分析的兩種技術(shù)：亞硫酸氫鹽掛鎖探針(BSPP)和甲基敏感的切割計數(shù)(MSCC)。
[0008]Brunner等人(2009)Genome Res.,19(6):1044
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1056，報道了Methyl
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seq，一種測定整個基因組多于90,000個區(qū)域處的DNA甲基化的方法。Methyl
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seq將由甲基敏感的酶的DNA消化與下一代(next
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gen)DNA測序技術(shù)組合。
[0009]Jelinek等人(2012)Epigenetics,7:12,1368
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1378，報道了一種名為甲基化的數(shù)字限制性酶分析(DREAM)的方法，該方法基于通過用以下的一對識別相同序列的異裂殖(neoschizomeric)限制性酶順序消化基因組DNA所產(chǎn)生的甲基化特異性特征(methylation
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specific signatures)的下一代測序分析：甲基化敏感的酶Sma和甲基化不敏感的酶XmaI。
[0010]Marsh和Pasqualone(2014)Front Physiol,5:173，報道了來自南極洲McMurdo Sound的海洋多毛類Spiophanes tcherniai中的甲基胞嘧啶組成模式的表征。甲基化模式使用通過甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶的DNA消化及隨后的下一代測序來表征。
[0011]Marsh等人(2016)Front Genet.,7:191，報道了使用甲基敏感的限制性內(nèi)切核酸酶(MSRE)從下一代測序(NGS)數(shù)據(jù)計算機地重構(gòu)位點特異性CpG甲基化狀態(tài)的定量方法。
[0012]Viswanathan等人(2019)Nucleic Acids Research,47(19):e122，報道了一種能夠定量分析同一樣品中的非甲基化DNA和甲基化DNA的單管酶促方法，通過限制性酶的DNA分析(DARE)。兩種甲基化狀態(tài)的信息都是通過順序地被一對甲基化敏感的限制性酶和不敏感的限制性酶消化的DNA片段的差異加銜接子標(biāo)簽(differential adapter tagging)來捕獲的。
[0013]Pereira等人(2020)PLoS ONE,15(6):e0233800，報道了一種名為甲基敏感的DArT
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seq(MS
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DArT
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seq)的技術(shù)，該技術(shù)基于基因組的雙重消化及隨后的特定銜接子連接和下一代測序的組合。使用靶向CCGG位點并且顯示相反甲基化敏感度的限制性酶(MspI，甲基化不敏感的，和HpaII，如果內(nèi)部胞嘧啶是5
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甲基化的，則不裂解)平行構(gòu)建兩個文庫。
[0014]Tanaka等人(2020)Analytical Biochemistry,609:113977，報道了一種將甲基化敏感的限制性酶(MSRE)和下一代測序(NGS)組合以鑒定絨毛膜絨毛(CV)與母體血細(xì)胞(MBC)之間差異甲基化區(qū)域的方法。
[0015]美國專利10,392,666公開了DNA甲基化模式(甲基化組(methylome))的確定，并且更特別地，公開了包括來自不同基因組(例如，來自胎兒和母親，或來自腫瘤和正常細(xì)胞)的DNA混合物的生物樣品(例如，血漿)的分析，以確定少數(shù)基因組的甲基化模式(甲基化組)。
[0016]WO 2016/061624公開了用于鑒定基因或基因組內(nèi)適于甲基化分析的位點和區(qū)域的方法。該方法允許在全基因組范圍內(nèi)有效鑒定為隨后分析提供靶的靶限制性位點和片段。
[0017]WO 2018/195211公開了用于構(gòu)建文庫的組合物、試劑盒和方法，所述組合物、試劑盒和方法用于同時檢測有限D(zhuǎn)NA輸入(諸如受試者體內(nèi)的循環(huán)多核苷酸片段，包括循環(huán)腫瘤DNA)上的基因組變體和DNA甲基化狀態(tài)。
[0018]授予本專利技術(shù)申請人的WO 2011/070441、WO 2017/006317、WO2019/142193和WO 2020/188561公開了用于檢測DNA樣品中甲基化改變的方法。
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【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】1.一種用于對來自受試者的無細(xì)胞DNA(cfDNA)樣品的遺傳特征和表觀遺傳特征進(jìn)行譜分析的方法，所述方法包括：(a)使所述無細(xì)胞DNA樣品經(jīng)歷用至少一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶消化，以獲得其中甲基化位點完整且非甲基化位點被切割的限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA；(b)從所述限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA制備測序文庫，同時保存所述DNA分子末端處的序列信息，其中制備所述測序文庫包括將測序銜接子與所述限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA中的DNA分子連接，其中每個銜接子能夠與消化的DNA分子和未消化的DNA分子兩者連接；(c)通過高通量測序方法對所述測序文庫進(jìn)行測序，以提供測序數(shù)據(jù)；以及(d)根據(jù)所述測序數(shù)據(jù)確定所述無細(xì)胞DNA樣品的至少一個限制性基因座的甲基化值和任選地選自DNA突變、拷貝數(shù)變異和核小體定位的至少一個另外的遺傳特征或表觀遺傳特征，其中包含3000個單倍體當(dāng)量的無細(xì)胞DNA的量對于所述方法是足夠的，其中所述無細(xì)胞DNA樣品在文庫制備之前不經(jīng)歷擴增，并且其中確定所述無細(xì)胞DNA樣品的所述甲基化值和所述至少一個另外的遺傳特征或表觀遺傳特征基于同一測序數(shù)據(jù)進(jìn)行。2.一種用于處理無細(xì)胞DNA樣品以獲得用于遺傳分析和表觀遺傳分析的測序數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括：(a)使所述無細(xì)胞DNA樣品經(jīng)歷用至少一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶消化，以獲得其中甲基化位點完整且非甲基化位點被切割的限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA；(b)從所述限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA制備測序文庫，同時保存所述DNA分子末端處的序列信息，其中制備所述測序文庫包括將測序銜接子與所述限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA中的DNA分子連接，其中每個銜接子能夠與消化的DNA分子和未消化的DNA分子兩者連接；以及(c)通過高通量測序方法對所述測序文庫進(jìn)行測序，以獲得測序數(shù)據(jù)，其中包含3000個單倍體當(dāng)量的無細(xì)胞DNA的量足以實現(xiàn)以下的至少一項：至少85％的獨特映射率、與未消化的樣品相比至少0.65的Pearson相關(guān)性表征的拷貝數(shù)完整性和與未消化的樣品相比至少0.55的Pearson相關(guān)性表征的核小體定位完整性，并且其中遺傳分析和表觀遺傳分析基于同一測序數(shù)據(jù)進(jìn)行。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中包含6,000個單倍體當(dāng)量的無細(xì)胞DNA的量對于所述方法是足夠的。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述無細(xì)胞DNA是血漿無細(xì)胞DNA，并且其中所述無細(xì)胞DNA的量是從9ml
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10ml血液中獲得的量。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述無細(xì)胞DNA的量在10ng
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200ng之間。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述無細(xì)胞DNA的量在20ng
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100ng之間。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述至少一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生非平端，并且所述方法還包括在連接測序銜接子之前使所述限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA經(jīng)歷末端修復(fù)，以獲得具有平端的DNA分子。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述高通量測序是全基因組高通量測序。9.根據(jù)權(quán)利要求1
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8中任一項所述的方法，其中所述高通量測序是靶特異性高通量測序。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中確定至少一個限制性基因座的甲基化值包括：(i)選擇至少一個限制性基因座并且確定覆蓋長度為至少50bp的包含所述限制性基因座的預(yù)定義基因組區(qū)域的序列讀段的數(shù)目；以及(ii)基于在步驟(i)中確定的讀段計數(shù)和參考讀段計數(shù)，計算所述至少一個限制性基因座的甲基化值。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟(i)包括確定覆蓋長度為至少100bp的包含所述限制性基因座的預(yù)定義基因組區(qū)域的序列讀段的數(shù)目。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述至少一個限制性基因座是多于一個限制性基因座。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述至少一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶是多于一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶，并且其中用所述多于一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶的消化是同時消化。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多于一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶包括HinP1I。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多于一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶包括AciI。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述消化使用HinP1I和AciI進(jìn)行。17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中使所述無細(xì)胞DNA樣品經(jīng)歷用至少一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶消化的步驟還包括確定消化效率，并且如果所述消化效率高于預(yù)定義閾值，則繼續(xù)制備測序文庫。18.一種用于檢測來自受試者的無細(xì)胞DNA(cfDNA)樣品中的癌癥相關(guān)遺傳改變和表觀遺傳改變的方法，所述方法包括：根據(jù)權(quán)利要求1
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17中任一項對所述cfDNA樣品的甲基化和任選地至少一個另外的遺傳特征和表觀遺傳特征進(jìn)行譜分析，以獲得所述cfDNA樣品的遺傳譜和表觀遺傳譜；并且將所述cfDNA樣品的遺傳譜和表觀遺傳譜與選自癌癥譜和非癌癥譜的一個或更多個參考遺傳譜和參考表觀遺傳譜進(jìn)行比較，以檢測所述cfDNA樣品中癌癥相關(guān)的遺傳改變和表觀遺傳改變。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述無細(xì)胞DNA樣品來自疑似具有癌癥或處于具有癌癥風(fēng)險的受試者，并且所述方法還包括在檢測到癌癥相關(guān)的改變時向所述受試者施用主動癌癥監(jiān)測和隨訪測試，所述癌癥監(jiān)測和隨訪測試包括血液測試、尿液測試、細(xì)胞學(xué)、成像、內(nèi)窺鏡檢查和活檢中的一種或更多種。20.一種用于評價受試者中癌癥的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)使所述受試者的無細(xì)胞DNA(cfDNA)樣品經(jīng)歷用至少一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶消化，以獲得其中甲基化位點完整且非甲基化位點被切割的限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA；
(b)通過高通量測序方法對所述限制性內(nèi)切核酸酶處理的DNA進(jìn)行測序；(c)選擇至少一個多組基因組區(qū)域，所述多組基因組區(qū)域包含彼此在150bp內(nèi)的腫瘤高甲基化限制性基因座和腫瘤突變基因座；以及(d)基于覆蓋所述至少一個多組區(qū)域的序列讀段分析，確定所述受試者具有癌癥的可能性。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述至少一個多組區(qū)域包含彼此在100bp內(nèi)的腫瘤高甲基化限制性基因座和腫瘤突變基因座。22.根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法，其中覆蓋所述至少一個多組區(qū)域的序列讀段的分析包括：
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對于每個多組區(qū)域確定以下的至少一項：(i)覆蓋所述多組區(qū)域的甲基化的突變的序列讀段的數(shù)目，所述甲基化的突變...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丹尼，
申請(專利權(quán))人：紐克萊克斯有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：