一種級聯(lián)檢測ctDNA的方法、探針、試劑盒及系統(tǒng)技術方案

本發(fā)明專利技術公開了一種級聯(lián)檢測ctDNA的方法、探針、試劑盒及系統(tǒng)。所述探針包括發(fā)夾探針H1、H2、H3、H4和報告分子；并構建了一種高穩(wěn)定的級聯(lián)恒溫無酶核酸信號擴增系統(tǒng)，解決單級恒溫無酶核酸信號擴增系統(tǒng)難以檢測低豐度生物標志物ctDNA的問題，而且本發(fā)明專利技術構建的級聯(lián)恒溫無酶CHA反應系統(tǒng)，在精準設計兩級核酸信號擴增線路后，還在報告分子序列中引入高穩(wěn)定性的鎖核苷酸，極大地可提高級聯(lián)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。同時，無需高成本酶，因不需反復升降溫，反應時間短且不需依賴于體積大和價格較高的精密儀器，解決了現(xiàn)有ctDNA檢測方法操作繁瑣、耗時長和成本高的等問題。本高的等問題。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】
一種級聯(lián)檢測ctDNA的方法、探針、試劑盒及系統(tǒng)


[0001]本專利技術屬于基因檢測領域，具體涉及一種級聯(lián)檢測ctDNA的方法、探針、試劑盒及系統(tǒng)。

技術介紹

[0002]癌癥是當前人類健康最大的威脅，現(xiàn)癌癥發(fā)現(xiàn)常處于癌癥高發(fā)展階段且已經(jīng)發(fā)生轉移，造成癌癥仍是當今死亡的主要原因。因此，“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”是當前癌癥臨床治療的最佳途徑和重要目標。目前，血清學中癌癥標志物的檢測是一種有前景、無創(chuàng)早期篩查的檢測方法，具有簡便和可重復性等優(yōu)勢。其中，循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是由腫瘤細胞在凋亡或壞死過程中釋放到血液中的基因組片段，通常由90～150個核苷酸構成，在癌癥患者血清中異常表達且攜帶腫瘤特異性的遺傳學信息，且因其在血液中的半衰期較短(一般小于2h，而大多數(shù)蛋白生物標志物的半衰期可達數(shù)周)更能反饋腫瘤的實時狀態(tài)信息，被認為是目前具有應用前景的血清學中癌癥標志物檢測(液體活檢)靶標之一。由于癌癥患者血清學中腫瘤標志物ctDNA的豐度很低，因此需要匹配一種高靈敏度的ctDNA信號擴增檢測方法。
[0003]目前主要基于DNA測序和逆轉錄聚合酶鏈式擴增(RT
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PCR)實現(xiàn)癌癥患者血清樣本中ctDNA檢測。然而，DNA測序方法操作耗時長(通常需要2
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3周)且成本較高；RT
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PCR雖是目前最廣泛應用的技術，但是方法操作繁瑣、需要嚴格設計引物且依賴體積大、價格較高、反應時間長的精密循環(huán)溫控儀器，極大的限制了其在基層醫(yī)院的推廣和現(xiàn)場檢測。恒溫核酸信號擴增系統(tǒng)可克服現(xiàn)有ctDNA檢測系統(tǒng)的局限性。其中，相較于恒溫有酶核酸信號擴增系統(tǒng)，恒溫無酶核酸信號擴增CHA反應系統(tǒng)不依賴于對外界環(huán)境敏感、容易失活、穩(wěn)定性較差且成本較高的酶系統(tǒng)，且制備過程簡單。因此，亟需發(fā)展一種恒溫無酶信號擴增的液體活檢方法用于乳腺癌患者血清中ctDNA高靈敏、方便、現(xiàn)場檢測。
[0004]常規(guī)級聯(lián)的恒溫無酶CHA反應系統(tǒng)(CHA，催化發(fā)夾自組裝)(Stacking nonenzymatic circuits for high signal gain.PNAS,2013,110,5386
?
5391)比單級恒溫無酶CHA反應系統(tǒng)的信號擴增能力更強，更適用于檢測低豐度生物標志物，但是常規(guī)級聯(lián)系統(tǒng)的報告分子序列全部為脫氧核糖核苷酸，穩(wěn)定性差，容易受生物環(huán)境中酶的降解而發(fā)生信號泄漏。
[0005]因此，本專利技術構建了一種高穩(wěn)定性的級聯(lián)恒溫無酶CHA反應體系。通過精準設計兩級核酸信號擴增線路，以及在報告分子序列中引入高穩(wěn)定性的鎖核苷酸，可提高級聯(lián)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，為乳腺癌的早期診斷提供一種集“輸入
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放大
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輸出”為一體的智能小分子診斷工具。

技術實現(xiàn)思路

[0006]本專利技術第一方面的目的，在于提供一種ctDNA探針組。
[0007]本專利技術第二方面的目的，在于提供上述ctDNA探針組的應用。
[0008]本專利技術第三方面的目的，在于提供一種試劑盒。
[0009]本專利技術第四方面的目的，在于提供一種檢測系統(tǒng)。
[0010]本專利技術第五方面的目的，在于提供一種檢測ctDNA的方法。
[0011]本專利技術所采取的技術方案是：
[0012]本專利技術的第一方面，提供一種ctDNA探針組；所述ctDNA探針組包括發(fā)夾序列H1、發(fā)夾序列H2、發(fā)夾序列H3、發(fā)夾序列H4；
[0013]所述發(fā)夾序列H1從5
’
端開始依次為1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*區(qū)域，其中1、2和3區(qū)域與ctDNA的1*，2*和3*區(qū)域互補；
[0014]所述發(fā)夾序列H2從5
’
端開始依次為3、4、3*、2*和4*區(qū)域，其中發(fā)夾序列H2的3和4區(qū)域序列與發(fā)夾探針H1的3*和4*區(qū)域序列互補；
[0015]所述發(fā)夾探針H3從5
’
端開始依次為9、8、5*、6*、7*、6、5和2區(qū)域，其中發(fā)夾探針H3的2、5和6區(qū)域與發(fā)夾探針H1的2*、5*和6*區(qū)域互補；
[0016]所述發(fā)夾探針H4從5
’
端開始依次為7*、5*、6*、7和6區(qū)域，其中發(fā)夾探針H4的6和7區(qū)域與發(fā)夾探針H3的6*和7*區(qū)域互補。
[0017]優(yōu)選地，所述ctDNA探針組還包括報告序列組，所述報告序列組包括Reporter
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F和Reporter
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Q；
[0018]所述Reporter
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F序列從5
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端開始依次為5、8*和9*區(qū)域；所述Reporter
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Q從5
’
端開始依次為9和8區(qū)域；所述Reporter
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Q與Reporter
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F序列的8*和9*區(qū)域互補；所述Reporter
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F序列的5、8*和9*區(qū)域與發(fā)夾探針H3的5*、8和9序列互補。
[0019]優(yōu)選地，所述ctDNA為乳腺癌ctDNA。
[0020]優(yōu)選地，所述ctDNA為PIK3CA E545K；所述PIK3CA E545K的序列為：5
’?
CTCAGTGA TTTTAGA GAGAGGAT
?3’
。
[0021]優(yōu)選地，所述發(fā)夾探針H1的序列為：5
’?
ATCCTCTC TCTAAAA TCACTGAG CCATGTGTAGA CTCAGTGA TTTTAGA CCTTGTCA TAGAGCAC
?3’
；
[0022]所述發(fā)夾探針H2的序列為：5
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TCACTGAG TCTACACATGG CTCAGTGA TTTTAGA CCATGTGTAGA
?3’
；
[0023]所述發(fā)夾探針H3的序列為：5
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GAAATCGG GTGTAGTC CCTTGTCA TAGAGCAC GCACCTCCTATATCG GTGCTCTA TGACAAGG TCTAAAA
?3’
；
[0024]所述發(fā)夾探針H4的序列為：5
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GCACCTCCTATATCG CCTTGTCA TAGAGCAC CGATATAGGAGGTGC GTGCTCTA
?3’
；
[0025]所述Reporter
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F的序列為：5
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TGACAAGG GACTACAC CCGATTTCCCAT
?3’
；
[0026]優(yōu)選地，所述Reporter
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F中的堿基包括鎖苷酸修飾的堿基。
[0027]優(yōu)選地，所述鎖苷酸修飾的堿基數(shù)量為2～6個。
[0028]優(yōu)選地，所述Reporter
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F中從5
’
起的第11、15、19、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種ctDNA探針組；所述ctDNA探針組包括發(fā)夾序列H1、發(fā)夾序列H2、發(fā)夾序列H3、發(fā)夾序列H4；所述發(fā)夾序列H1從5
’
端開始依次為1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*區(qū)域，其中1、2和3區(qū)域與ctDNA的1*，2*和3*區(qū)域互補；所述發(fā)夾序列H2從5
’
端開始依次為3、4、3*、2*和4*區(qū)域，其中發(fā)夾序列H2的3和4區(qū)域序列與發(fā)夾探針H1的3*和4*區(qū)域序列互補；所述發(fā)夾探針H3從5
’
端開始依次為9、8、5*、6*、7*、6、5和2區(qū)域，其中發(fā)夾探針H3的2、5和6區(qū)域與發(fā)夾探針H1的2*、5*和6*區(qū)域互補；所述發(fā)夾探針H4從5
’
端開始依次為7*、5*、6*、7和6區(qū)域，其中發(fā)夾探針H4的6和7區(qū)域與發(fā)夾探針H3的6*和7*區(qū)域互補。2.根據(jù)權利要求1所述的ctDNA探針組，其特征在于所述ctDNA探針組還包括報告序列組，所述報告序列組包括Reporter
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F和Reporter
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Q；所述Reporter
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F序列從5
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端開始依次為5、8*和9*區(qū)域；所述Reporter
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Q從5
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端開始依次為9和8區(qū)域；所述Reporter
?
Q與Reporter
?
F序列的8*和9*區(qū)域互補；所述Reporter
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F序列的5、8*和9*區(qū)域與發(fā)夾探針H3的5*、8和9序列互補。3.根據(jù)權利要求1所述的ctDNA探針組，其特征在于，所述ctDNA為乳腺癌ctDNA；優(yōu)選地，所述ctDNA為PIK3CA E545K；優(yōu)選地，所述PIK3CA E545K的序列為：5
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CTCAGTGA TTTTAGAGAGAGGAT
?3’
。4.根據(jù)權利要求1～3任一項所述的ctDNA探針組，其特征在于，所述發(fā)夾探針H1的序列為：5
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ATCCTCTC TCTAAAA TCACTGAGCCATGTGTAGA CTCAGTGA TTTTAGA CCTTGTCA TAGAGCAC
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；所述發(fā)夾探針H2的序列為：5
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TCACTGAG TCTACACATGG CTCAGTGATTTTAGA CCATGTGTAGA
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；所述發(fā)夾探針H3的...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：譚凱月，鄒麗麗，呂倩，
申請(專利權)人：廣東省科學院生物與醫(yī)學工程研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：