一種腫瘤標(biāo)志物的篩選系統(tǒng)和方法技術(shù)方案

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于cfDNA和ATAC

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種腫瘤標(biāo)志物的篩選系統(tǒng)和方法


[0001]本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)
，具體涉及一種腫瘤標(biāo)志物的篩選系統(tǒng)和方法。

技術(shù)介紹

[0002]在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的時代背景下，液體活檢技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，液體活檢可以反映出腫瘤的基因組全貌，在減小腫瘤異質(zhì)性對診斷造成偏差的同時，也能及時地反應(yīng)腫瘤發(fā)展的動態(tài)變化。細(xì)胞游離DNA(cell free DNA，cfDNA)是最常用的液體活檢分析物。cfDNA是來源于細(xì)胞凋亡和壞死，游離于細(xì)胞外的DNA片段。其中有來自正常細(xì)胞的DNA，也有來自腫瘤細(xì)胞的DNA(ctDNA)。目前常用的技術(shù)手段是通過檢測cfDNA中的特定基因突變或者甲基化特征來表征ctDNA豐度，監(jiān)測腫瘤的信號，該類型檢測依賴于深度靶向測序，克隆造血引起的高頻率改變可能會混淆這些結(jié)果，導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。
[0003]cfDNA可用于更好地鑒定腫瘤信號，研究者通過全基因組測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的片段大小分布與健康人有著明顯的差異，凋亡細(xì)胞中不被核小體結(jié)合的DNA片段
?
染色質(zhì)開放區(qū)間，釋放到血液中后，由于缺少核小體保護(hù)，更容易被核酸酶降解，該區(qū)域內(nèi)的cfDNA的測序覆蓋率會下降，而這類染色質(zhì)開放區(qū)間大多集中在基因的啟動子區(qū)域，因此通過檢測cfDNA片段覆蓋度能夠反應(yīng)腫瘤基因表達(dá)模式。這種檢測方式能夠更全局地檢測體內(nèi)的異常基因表達(dá)模式，提高了檢測的靈敏度。
[0004]中國專利CN202011009109.3中公開了一種預(yù)測腫瘤組織cfDNA的方法及系統(tǒng)，所述的方法包括以下步驟：待測樣本特征提取步驟，包括提取待測樣本的cfDNA測序數(shù)據(jù)的末端特征和Kmer頻數(shù)特征；預(yù)測步驟，包括通過模型，對待測樣本的cfDNA測序數(shù)據(jù)的末端特征和Kmer頻數(shù)特征進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果，預(yù)測所述待測樣本是否為健康樣本或腫瘤樣本。但是依賴于全基因組測序的方法進(jìn)行腫瘤檢測，測序成本高，并且測序覆蓋深度低。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)表了基于基因啟動子區(qū)域染色質(zhì)開放性篩查癌癥技術(shù)，此技術(shù)采用靶向捕獲基因啟動子區(qū)域cfDNA序列結(jié)合深度測序的方法，通過分析靶點區(qū)域cfDNA片段長度分布，判斷腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)模式，從而區(qū)分腫瘤病人和健康人血液，并對腫瘤進(jìn)行精確溯源，該方法大大提高了靶點區(qū)域的覆蓋深度，有望進(jìn)一步提升cfDNA的檢測靈敏度。
[0006]而這種基于靶向捕獲檢測染色質(zhì)開放區(qū)間這類的早篩技術(shù)，最重要的一個問題是建立腫瘤特異染色質(zhì)開放區(qū)間圖譜，目前用于腫瘤篩查的染色質(zhì)開放區(qū)間的靶點主要通過分析微球菌核酸酶測序(micrococcal nuclease
?
seq，MNase
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seq)測序數(shù)據(jù)，MNase
?
seq是一種檢測染色質(zhì)開放性的方法，MNase同時具有核酸外切酶和內(nèi)切酶活性，優(yōu)先對裸露的DNA或核小體之間起連接作用的DNA進(jìn)行切割消化，然后對DNA的兩條鏈依次內(nèi)切形成雙鏈末端，并從末端向片段的中心位置逐個切下堿基對，遇到核小體或DNA結(jié)合蛋白等阻滯物后停止。
[0007]癌癥基因組圖譜(The cancer genome Atlas，TCGA)中也收錄了多個基于腫瘤組織的MNase
?
seq數(shù)據(jù)。雖然這種測序方法應(yīng)用廣泛，但是這種方法需要投入的細(xì)胞量較多(約10
?
20百萬個)，具有序列特異性偏好性，很難滿足少量腫瘤組織樣本(比如活檢、穿刺組
織)和對腫瘤組織單細(xì)胞分辨率的染色質(zhì)開放區(qū)間的特征的鑒定。
[0008]目前，亟需一種細(xì)胞投入量少，檢測的靈敏度更高的腫瘤標(biāo)志物的篩選系統(tǒng)和方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0009]本專利技術(shù)的目的是提供一種基于cfDNA和ATAC
?
seq的腫瘤標(biāo)志物篩選系統(tǒng)和方法，減少了細(xì)胞投入量，提高了信噪比。
[0010]為實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：
[0011]一方面，本專利技術(shù)提供了一種基于cfDNA和ATAC
?
seq的腫瘤標(biāo)志物的篩選系統(tǒng)，所述的篩選系統(tǒng)包括腫瘤組織處理模塊、染色質(zhì)開放區(qū)間捕獲模塊、靶點篩選模塊、靶點確認(rèn)和驗證模塊，所述的靶點篩選模塊包括：
[0012]S1、使用軟件將序列片段比對到參考基因組上；
[0013]S2、將S1對比得到的結(jié)果使用samtools進(jìn)行過濾和排序；
[0014]S3、找出ATAC數(shù)據(jù)的峰值分布；
[0015]S4、將篩選得到的特異性峰值與健康人群體中特異性的峰值，進(jìn)行差異峰值分析，篩選得到腫瘤特異性染色質(zhì)開放區(qū)間；
[0016]S5、分析得到在群體中共有的峰值，作為靶點。
[0017]優(yōu)選地，步驟S1前還包括S0、去除序列的接頭，去除Phred質(zhì)量得分小于20的低質(zhì)量序列，并統(tǒng)計質(zhì)量值。
[0018]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的步驟S0中去除序列接頭所使用的的軟件為trim
?
galore。參數(shù)為：trim_galore
??
fastqc
??
quality 20
??
paired
??
phred33。
[0019]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的步驟S0中統(tǒng)計質(zhì)量值所使用的軟件為fastqc。
[0020]優(yōu)選地，S1中所述的軟件選自STAR、BWA、Bowtie2中的一種或多種。
[0021]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的步驟S1中所用的軟件為Bowtie2，對比得到的為bam文件。重要參數(shù)為：bowtie2
??
very
?
sensitive
?
X 2000。
[0022]優(yōu)選地，步驟S1中比對數(shù)據(jù)包括ATAC數(shù)據(jù)和RNA
?
seq數(shù)據(jù)。
[0023]優(yōu)選地，S2中所述的samtools的參數(shù)為samtools sort
?
O bam
?
@4。
[0024]優(yōu)選地，步驟S2還包括使用sambamba軟件去除PCR重復(fù)步驟。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的去除PCR重復(fù)的參數(shù)為sambamba markdup
?
r
?
t。
[0026]優(yōu)選地，步驟S2后還包括使用內(nèi)部開發(fā)程序?qū)am文件轉(zhuǎn)化為bed文件的步驟。
[0027]優(yōu)選地，步驟S3中找出ATAC數(shù)據(jù)峰值分布的軟件選自MACS2、Genrich、HMMCATAC中的一種或多種。
[0028]進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟S3中找出ATAC數(shù)據(jù)峰值分布的軟件為MACS2。
[0029]再進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的MACS2的參數(shù)為macs2 callpeak
?
f BED
?
g hs
?
B
??
nolambda
??
nomodel。
[0030]優(yōu)選地，步驟S3前，還包括根據(jù)Tn5酶的切割特點，對本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于cfDNA和ATAC
?
seq的腫瘤標(biāo)志物的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的篩選系統(tǒng)包括腫瘤組織處理模塊、染色質(zhì)開放區(qū)間捕獲模塊、靶點篩選模塊、靶點確認(rèn)和驗證模塊，所述的靶點篩選模塊包括：S1、使用軟件將序列片段比對到參考基因組上；S2、將S1對比得到的結(jié)果使用samtools進(jìn)行過濾和排序；S3、找出ATAC數(shù)據(jù)的峰值分布；S4、將篩選得到的特異性峰值與健康人群體中特異性的峰值，進(jìn)行差異峰值分析，篩選得到腫瘤特異性染色質(zhì)開放區(qū)間；S5、分析得到在群體中共有的峰值，作為靶點。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的腫瘤組織處理模塊包括單細(xì)胞懸液的制備和不同群體的細(xì)胞分選；所述的上皮細(xì)胞分選選用可特異性識別CD326抗體；免疫細(xì)胞分選選用特異性識別CD45抗體；成纖維細(xì)胞選用可特異性識別PDPN抗體或者PDGFRA抗體；內(nèi)皮細(xì)胞分選選用特異性識別CD31抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的染色質(zhì)開放區(qū)間捕獲模塊包括使用ATAC
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seq建庫技術(shù)對染色質(zhì)開放區(qū)間進(jìn)行捕獲，所述的ATAC
?
seq建庫技術(shù)包括：(1)將權(quán)利要求2中所述的分選后的細(xì)胞離心，棄上清；(2)進(jìn)行Tn5打斷；(3)片段化產(chǎn)物純化；(4)PCR擴(kuò)增，純化，測序；步驟(2)中所述的Tn5打斷體系包括Tn5酶、牛血清白蛋白、毛地黃皂苷、吐溫、乙基苯基聚乙二醇、二甲基甲酰胺和細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的Tn5打斷體系中細(xì)胞的濃度為60
?
1000個/μL。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的Tn5打斷體系中Tn5酶的體積比為0.05
?
2。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述的Tn5打斷體系中毛地黃皂苷的終濃度為0.005

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：藍(lán)勛，王莉惠，
申請(專利權(quán))人：人科北京生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：