一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法。設(shè)計莖含有3堿基錯配和7堿基粘性末端的HP發(fā)夾，加入靶標(biāo)miRNA

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法


[0001]本專利技術(shù)屬于生物化學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法。

技術(shù)介紹

[0002]在21世紀(jì)，癌癥已經(jīng)嚴(yán)重危害到人們的生命健康，癌癥被發(fā)現(xiàn)時大多處于癌癥晚期，治療難度大且治療成功率小。癌癥早期診斷技術(shù)對于癌癥的預(yù)防、治療和愈后都至關(guān)重要。microRNA(miRNA)在癌細(xì)胞中過表達(dá)，能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)并與癌細(xì)胞的增殖遷移有關(guān)。miRNA
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21在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，miRNA
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375在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。因此，miRNA作為癌癥生物標(biāo)志物用于癌癥早期篩查，但是由于miRNA體積小，需要開發(fā)靈敏度高的檢測方法?，F(xiàn)有檢測miRNA的核酸生物傳感器所采用的信號放大方法種類較多。CHA、熵驅(qū)動等信號放大技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)循環(huán)，但對序列設(shè)計有特定要求且容易產(chǎn)生較高的假陽性背景信號。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0003]有鑒于此，本專利技術(shù)提供一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法。本專利技術(shù)中我們提出利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性APE1酶輔助miRNA靶標(biāo)循環(huán)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)構(gòu)建具有雙重信號放大的熒光生物傳感器。該方案的雙重信號放大策略能夠?qū)崿F(xiàn)對低濃度靶標(biāo)的靈敏檢測，提高生物傳感器的靈敏度。滾環(huán)擴(kuò)增得到含有G四聯(lián)體的DNA鏈原位增強(qiáng)硫磺素T熒光信號用于快速實現(xiàn)熒光檢測。/>[0004]本專利技術(shù)具體提供了如下的技術(shù)方案：
[0005]1、一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法，步驟為：
[0006]1)設(shè)計莖含有3堿基錯配和7堿基粘性末端的HP發(fā)夾，在ThermoPol緩沖溶液中退火形成發(fā)夾，靶標(biāo)miRNA
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21雜交HP發(fā)夾并反應(yīng)2h得到miRNA
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21/HP雙鏈；
[0007]2)隨后加入APE1酶反應(yīng)，通過APE1酶切割miRNA
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21/HP雙鏈中AP位點釋放靶標(biāo)miRNA
?
21參與下一個循環(huán)及HP1參與RCA反應(yīng)；
[0008]3)設(shè)計啞鈴型DP環(huán)狀模板鏈，在T4緩沖溶液中退火形成啞鈴型結(jié)構(gòu)后加入T4 DNA連接酶環(huán)化；HP1與啞鈴型DP環(huán)狀模板雜交，在Bst聚合酶驅(qū)動下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)得到含有G四聯(lián)體的DNA長鏈，加入KCl形成G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，然后硫磺素T嵌插進(jìn)G四聯(lián)體中實現(xiàn)熒光信號增強(qiáng)；
[0009]4)特異性檢測：加入靶標(biāo)miRNA
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21和miRNA
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155，真實樣本檢測：實驗組加入10％血清，加入不同濃度的miRNA
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21，利用熒光分光光度計檢測熒光信號強(qiáng)度(Ex＝440nm)。
[0010]進(jìn)一步，步驟1)中制備含有AP位點的發(fā)夾HP，PCR程序：75℃處理5min；
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5℃/min降至40℃；
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1℃/min降至37℃，然后在
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20℃保存。
[0011]進(jìn)一步，步驟2)中優(yōu)化APE1酶濃度和反應(yīng)時間：HP為1μM，miRNA
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21為1μM，1
×
ThermoPol緩沖溶液，反應(yīng)總體積10μL，APE1酶濃度為0.05U/μL，37℃反應(yīng)時間為1h，隨后65℃處理20min使APE1酶失活。
[0012]進(jìn)一步，步驟3)中優(yōu)化Bst聚合酶濃度為0.2U/μL。
[0013]進(jìn)一步，步驟3)中優(yōu)化dNTPs濃度為0.5mM。
[0014]進(jìn)一步，步驟3)中優(yōu)化滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)時間為3h。
[0015]進(jìn)一步，步驟4)中熒光分光光度計檢測熒光信號強(qiáng)度(HITACHI F7000，Ex＝440nm)。
[0016]本專利技術(shù)的有益效果在于：在本專利技術(shù)中基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)和內(nèi)源性酶構(gòu)建雙重信號放大熒光生物傳感器實現(xiàn)了對miRNA
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21的高靈敏度檢測分析。當(dāng)靶標(biāo)miRNA
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21存在時，觸發(fā)APE1酶切割HP釋放HP1，同時釋放miRNA
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21實現(xiàn)靶標(biāo)循環(huán)；HP1結(jié)合啞鈴型模板DP鏈引發(fā)RCA反應(yīng)，在Bst聚合酶的作用下得到具有多重G四聯(lián)體重復(fù)單元的DNA長鏈，嵌入硫磺素硫磺素T產(chǎn)生熒光信號。該檢測方法所具有的雙重信號放大能夠提高生物傳感器的靈敏度，實現(xiàn)靶標(biāo)低濃度檢測，檢測限低至3.33pM。同時，該生物傳感器具有良好的特異性能夠有效區(qū)分多種miRNA的干擾，避免產(chǎn)生假陽性信號。最后，該生物傳感器在10％血清中仍具有良好的檢測能力能夠精準(zhǔn)檢測不同濃度靶標(biāo)。因此，我們提出的針對miRNA
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21的生物檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)在真實環(huán)境中的精準(zhǔn)檢測，有望將其用于疾病臨床診斷。
附圖說明
[0017]為了使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本專利技術(shù)提供如下附圖：
[0018]圖1為本專利技術(shù)的一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法的示意圖；
[0019]圖2為含有G四聯(lián)體的G4
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DNA鏈的最佳激發(fā)波長和最佳發(fā)射波長圖；
[0020]圖3為驗證實驗序列可行性的PAGE圖；
[0021]圖4為驗證熒光可行性驗證RCA產(chǎn)物的熒光信號圖；
[0022]圖5為優(yōu)化APE1酶濃度及反應(yīng)時間的PAGE圖；
[0023]圖6為優(yōu)化Bst聚合酶濃度的熒光強(qiáng)度擬合圖；
[0024]圖7為優(yōu)化dNTPs濃度的熒光強(qiáng)度擬合圖；
[0025]圖8為優(yōu)化滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)時間的熒光強(qiáng)度擬合圖；
[0026]圖9為加入不同濃度的miRNA
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21檢測生物傳感器性能的熒光光譜圖；
[0027]圖10為加入不同靶標(biāo)檢測生物傳感器特異性分析的熒光光譜圖；
[0028]圖11為在10％血清樣本中加入靶標(biāo)檢測生物傳感器性能的熒光光譜圖；
具體實施方式
[0029]下面結(jié)合附圖，對本專利技術(shù)的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0030]實驗原理如圖1所示，(1)APE1酶輔助靶標(biāo)miRNA
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21循環(huán)并酶切HP發(fā)夾環(huán)釋放HP1，為第一重信號放大設(shè)計。為充分實現(xiàn)該步信號放大，我們設(shè)計HP發(fā)夾的莖含有3堿基錯配和7堿基粘性末端，能夠?qū)崿F(xiàn)APE1酶切以后HP1、HP2、miRNA
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21更好分離，并且HP單獨存在無靶標(biāo)時不會被APE1酶切。(2)制備環(huán)狀模板DP并雜交HP1引發(fā)RCA反應(yīng)，為第二重信號放大設(shè)
計。其中的DP啞鈴形環(huán)狀模板經(jīng)退火和T4 DNA連接酶連接后得到，然后前一步釋放的HP1由于其3
’
端為
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OH，當(dāng)與啞鈴型DP鏈雜交時可在聚合酶驅(qū)動下以啞鈴本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法，其特征在于，步驟為：1)設(shè)計莖含有3堿基錯配和7堿基粘性末端的HP發(fā)夾，在ThermoPol緩沖溶液中退火形成發(fā)夾，靶標(biāo)miRNA
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21雜交HP發(fā)夾并反應(yīng)2h得到miRNA
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21/HP雙鏈；2)隨后加入APE1酶反應(yīng)，通過APE1酶切割miRNA
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21/HP雙鏈中AP位點釋放靶標(biāo)miRNA
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21參與下一個循環(huán)及HP1參與RCA反應(yīng)；3)設(shè)計啞鈴型DP環(huán)狀模板鏈，在T4緩沖溶液中退火形成啞鈴型結(jié)構(gòu)后加入T4 DNA連接酶環(huán)化；HP1與啞鈴型DP環(huán)狀模板雜交，在Bst聚合酶驅(qū)動下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)得到含有G四聯(lián)體的DNA長鏈，加入KCl形成G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，然后硫磺素T嵌插進(jìn)G四聯(lián)體中實現(xiàn)熒光信號增強(qiáng)；4)特異性檢測：加入靶標(biāo)miRNA
?
21和miRNA
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155，真實樣本檢測：實驗組加入10％血清，加入不同濃度的miRNA
?
21，利用熒光分光光度計檢測熒光信號強(qiáng)度(Ex＝440nm)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合內(nèi)源性酶輔助檢測microRNA的熒光生物傳感器分析檢測方法，其特征在于，步驟1)所述的HP序列為5
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TCGGAACTA GTCAACATCXGTCTGATAAGCTATGACTAGACCTTCCGAATAGCTT
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；DP序列為5
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CG CGTTCCCAACCCGCCCTACCCAACGCGGTGGATGTTGACTAGTTCCGAATCCAC
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張瑛洧，楊宏群，王洪，李昕昊，劉子瑞，
申請(專利權(quán))人：北京化工大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：