一種組織解離劑及其制備方法和應用技術

本發明專利技術涉及生物醫學技術領域(IPC分類號G01N33/50)，尤其涉及一種組織解離劑及其制備方法和應用，制備原料包括：解離液和培養基，所述解離液包括酶活為100

【技術實現步驟摘要】
一種組織解離劑及其制備方法和應用


[0001]本專利技術涉及生物醫學
(IPC分類號G01N33/50)，尤其涉及一種組織解離劑及其制備方法和應用。

技術介紹

[0002]人體中的大多數組織是由數十億個細胞組成的，它們被ECM(細胞外基質)分子和CAMs(細胞粘附分子)固定在一起，為了從這些原始組織中分離出細胞進行細胞培養，一般需要在放入培養前將組織分離成單一細胞懸液。例如，在細胞治療過程中，單細胞可以被輸送到某些部位以治療特定的疾病，而不能直接輸送聚合體，聚合體不僅可以堵塞輸送裝置，也很難估計被輸送的實際細胞數量，此外，聚合體中的細胞由于受到營養和氧氣質量轉移的限制，更容易發生細胞死亡，而且聚合體不太可能遷移到損傷區域，對局部線索做出反應，并整合到宿主細胞結構中。單細胞懸液的產生對如生物分子的生產和臨床診斷等各種應用都極為重要，由于參與細胞粘附和細胞連接的成分在不同組織中有所不同，因此獲得單細胞懸液的過程非常復雜。
[0003]現有技術中已有一些方法來產生來自原始組織的單細胞懸液，例如使用物理力(機械解離)、酶(酶解)，或兩者結合的方式相互附著的細胞進行分離，或者通過細尼龍或不銹鋼網強制過濾。雖然所有這些方法在創建單細胞懸液方面都很有效，但所涉及的過度物理力往往導致大量的細胞死亡和細胞損傷。為了避免機械解離的負面影響，現階段的研究采用酶瞄準并裂解存在于ECM中的特定分子。例如，胰蛋白酶(可裂解精氨酸和賴氨酸殘基羧基側的多肽鏈)通常用于分離和解離單層培養物，而膠原酶通常用于解離原始組織和聚集物。然而，并不是所有的細胞類型都能用酶輕易地解離。對于易受酶解影響的細胞類型，酶可能對細胞有害，并對生成的單細胞隨后的生存和/或分裂的能力產生負面影響。例如，當使用胰蛋白酶分離神經干細胞(NSC)集合體時，相對于使用機械分離產生的單細胞，后續培養的單細胞的生長速度受到了不利影響，胰蛋白酶會裂解某些類別的細胞表面發射器受體，使得細胞遭到破壞，膠原蛋白酶在用于分離神經干細胞聚集體時，存在將單細胞裂解為碎片的風險。
[0004]中國專利CN115060885A公開了一種解離液及其制備方法和應用，由緩沖液、解離劑、蛋白保護劑、蛋白穩定劑和防腐劑組成解離液，然而，實驗中發現對細胞存活率有一定的影響。因此，開發一種細胞存活率高、解離效果好的解離液十分具有應用前景。

技術實現思路

[0005]本專利技術的第一個方面提供了一種組織解離劑，制備原料包括：解離液和培養基，所述解離液包括酶活為100
?
1000U/mg的復合酶。
[0006]在一些實施方式中，所述培養基可以選自本領域常用的種類，包括但不限于RPMI1640或DMEM。
[0007]在一些實施方式中，所述酶活為100
?
800U/mg。
[0008]在一些實施方式中，所述酶活為100
?
600U/mg。
[0009]在單細胞懸液的制備過程中，所用酶的活力對單細胞懸液的質量、細胞活力都有十分顯著的影響，一般情況下，酶的活力越高，對細胞外基質的分解效率也就越高，細胞分離的越徹底，但申請人在實驗中發現，酶活和懸液質量并不是一直呈線性關系的，當酶活過高后，細胞表面基質被過度分解，表面蛋白有損傷，一方面會影響細胞活性，出現碎細胞和細胞數量減少的問題，另一方面所得到的單細胞懸液會進一步影響下游實驗，例如在抗體染色試驗中會出現抗體無法結合的問題。
[0010]為了提高單細胞的解離效果，同時保證細胞活性，申請人在探究中發現復合酶的酶活為100
?
1000U/mg優選100
?
800U/mg最優選100
?
600U/mg時能夠同時滿足上述兩種效果，經大量實驗發現所制備的單細胞懸液中細胞與基質的解離效果好，細胞活性高，原因可能是特定酶活的復合酶在解離時能夠使得體系內酶活性分布更均勻，進一步提高解離效果。
[0011]在一些實施方式中，所述復合酶包括透明質酸酶、膠原酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、脂肪酶中的至少兩種。
[0012]在一些實施方式中，所述復合酶為透明質酸酶、膠原酶。
[0013]進一步地，所述透明質酸酶的酶活為500U/mg，優選來源為Sigma。
[0014]進一步地，所述膠原酶的酶活為150U/mg，優選來源為Sigma。
[0015]組織中的細胞外基質與細胞之間的連接由一系列不同的蛋白質和其他生物分子組成，這些組織成分需要特定的酶消化，才能將組織制備成單細胞懸液。透明質酸酶通過隨機降解透明質酸的β
?
N
?
乙酰己糖胺
?
[1
?
4]糖苷鍵，能夠對細胞外基質中的多糖進行消化，膠原酶能夠攻擊和降解結締組織中常見的三螺旋天然膠原纖維，破壞膠原蛋白中存在的肽鍵，有助于消化細胞外基質，使細胞釋放到懸浮液中。申請人發現，同時使用透明質酸酶、膠原酶進行復配，不僅能夠提高對細胞的解離效果，還意外的提高細胞產量，分析原因可能是二者的復配在體系內實現了酶平衡，減少了細胞貼壁現象。
[0016]在一些實施方式中，所述透明質酸酶、膠原酶的體積比為(1
?
3)：(1
?
3)。
[0017]進一步地，所述透明質酸酶、膠原酶的體積比為1:1。
[0018]現有技術中的解離液往往以蛋白酶為主要成分，解離效果較好，但高蛋白酶的體系一般會破壞細胞表面蛋白，申請人在調整體系配方時，意外的發現，當透明質酸酶、膠原酶的體積比為(1
?
3)：(1
?
3)優選1:1時，解離液既能夠實現良好的解離效果，又能保護細胞表面蛋白，提高細胞成活率，為下游實驗提供高品質活細胞。
[0019]在一些實施方式中，制備原料還包括：緩沖液、DNase I。
[0020]在細胞解離的過程中，破損的細胞會釋放出黏附物，單細胞懸液的粘度升高，造成結團，申請人繼續探究發現，在體系內加入一定量的DNA酶尤其是DNase I，能夠減少損傷細胞所帶來的粘滯性，降低細胞懸液的粘稠度，減少結團，原因可能是DNase I能夠通過降解死細胞裂解釋放的游離DNA阻止細胞聚集，同時不會啟動凋亡途徑。
[0021]進一步地，所述緩沖液可以選自本領域常用的種類，包括但不限于BSA。
[0022]本專利技術的第二個方面提供了一種消化方法，所述消化方法包括如下步驟：
[0023]S1.將組織與組織解離劑接觸進行消化，得到消化液；
[0024]S2.將消化液離心，獲得解離后的細胞，去紅處理后測定細胞存活率。
[0025]本專利技術的第三個方面提供了一種組織解離劑的制備方法，制備方法包括：在緩沖
液中加入復合酶、DNase I，混勻，調節pH至7.4，得到解離液，將解離液加入培養基中，得到解離劑。
[0026]本專利技術的第四個方面提供了一種組織解離劑在制備單細胞懸液中的應用。
[0本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種組織解離劑，其特征在于，制備原料包括：解離液和培養基，所述解離液包括酶活為100
?
1000U/mg的復合酶。2.根據權利要求1所述的組織解離劑，其特征在于，所述酶活為100
?
800U/mg。3.根據權利要求1所述的組織解離劑，其特征在于，所述酶活為100
?
600U/mg。4.根據權利要求3所述的組織解離劑，其特征在于，所述復合酶包括透明質酸酶、膠原酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、脂肪酶中的至少兩種。5.根據權利要求4所述的組織解離劑，其特征在于，所述復合酶為透明質酸酶和膠原酶，體積比為(1
?
3)：(1
?
3)。6.根據權利要求5所述的組織解離...

【專利技術屬性】
技術研發人員：柯中和，熊慧，李亞洲，李西艷，何俊彥，
申請(專利權)人：上海源奇生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：