一種生物合成角鯊烯的提取純化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于角鯊烯提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵液準(zhǔn)備、離心后菌體洗滌、高壓均質(zhì)破碎、兩相萃取旋蒸、柱層析旋蒸和除菌過濾步驟即得，或?qū)⑵渲械膬上噍腿⌒艉椭鶎游鲂舨襟E替換為烘干菌體、超臨界萃取以及分子蒸餾步驟。本發(fā)明專利技術(shù)中提純工藝簡單、回收率高和產(chǎn)品純度較高，純度上可在97%以上，且也可以達(dá)到100%的純度；并可避免了有機(jī)試劑的使用，大大節(jié)約了成本，綠色生態(tài)環(huán)保，極易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和推廣。極易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和推廣。極易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和推廣。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種生物合成角鯊烯的提取純化方法


[0001]本專利技術(shù)屬于角鯊烯提取
，尤其涉及一種生物合成角鯊烯的提取純化方法。

技術(shù)介紹

[0002]角鯊烯是一種三萜,是植物、動物和人類合成甾醇的中間體，廣泛存在于植物、動物和人體中。最開始是從深海鯊魚的肝油中真空分餾得到一種不飽和烴，化學(xué)式為C
30
H50,結(jié)構(gòu)式如下：。
[0003]角鯊烯是由角鯊烯合成酶合成，將兩個單位的法尼基焦磷酸(萜類和類固醇的直接前體)轉(zhuǎn)化為角鯊烯。
[0004]作為副類固醇，維生素D的生物合成也受角鯊烯的調(diào)節(jié)。此外，作為每個類固醇家族的前體，角鯊烯是人體的重要組成部分。在人類中，新生兒血液中的角鯊烯濃度最高，但其含量在30至40歲之間突然開始下降。
[0005]在人體中，角鯊烯由肝臟合成，并由皮脂腺大量分泌,占皮脂腺分泌脂質(zhì)的12%，通過小密度脂蛋白和極小密度脂蛋白在血液中被運(yùn)輸。人體中角鯊烯的最高濃度出現(xiàn)在皮膚脂質(zhì)中約500μg/g，在脂肪組織中約300μg/g；而在發(fā)生活性生物合成的器官中，濃度要低得多，如在肝臟中為75μg/g或在小腸中為42μg/g。
[0006]角鯊烯具有著廣泛的用途：角鯊烯在護(hù)膚品中的應(yīng)用，為角鯊烯對自由基的穩(wěn)定性使人體皮膚表面能夠抵抗脂質(zhì)過氧化,可作為保濕霜中的抗氧化劑、抗靜電劑和潤膚劑等。角鯊烯在保健品中的應(yīng)用，為角鯊烯對長期用腦過度、精力不足的腦力勞動者，經(jīng)常感覺疲勞、嗜睡、頭暈、記憶力下降、注意力不集中者，以及脂肪肝患者和經(jīng)常喝酒、肝臟負(fù)擔(dān)重的人群有緩解和保護(hù)作用。角鯊烯作為中間體的應(yīng)用，為角鯊烯是多種烷類和甾醇類物質(zhì)合成的中間體。角鯊烯在疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用，為角鯊烯在疾病治療和預(yù)防上有著非常廣泛的作用。角鯊烯與吐溫
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80、司班85、生育酚等按比例分別配制成的MF59佐劑與AS03佐劑已應(yīng)用于多款已批準(zhǔn)上市疫苗，并在全球范圍內(nèi)進(jìn)行了大規(guī)模接種充分證明了角鯊烯配制的新型佐劑的安全性及有效性，在人類的疾病預(yù)防上做出了重大貢獻(xiàn)。
[0007]角鯊烯對于乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和與Ras癌基因突變相關(guān)的類似腫瘤能起到一定的預(yù)防作用。角鯊烯可能通過以下機(jī)制起到抗癌作用:（1）通過內(nèi)源性膽固醇合成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)間接抑制HMG
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CoA還原酶，抑制Ras癌蛋白法尼化，限制HMG
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CoA (3
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羥基
?3?
甲基戊二酸單酰輔酶A)轉(zhuǎn)化為DNA合成和細(xì)胞增殖所必需的甲羥戊酸;（2）調(diào)節(jié)外源代謝酶的生物合成和功能，從而改變致癌物的代謝激活;
（3）作為自由基清除劑。
[0008]角鯊烯被認(rèn)為是鯊魚沒有癌癥的重要因素，因?yàn)轷忯~魚肝油中含有超過40%的角鯊烯，角鯊烯同樣被認(rèn)為是地中海地區(qū)人類癌癥發(fā)病率低的重要因素，因?yàn)榈刂泻５貐^(qū)的人們的飲食中含有大量的橄欖，橄欖中富含角鯊烯。
[0009]由于角鯊烯的廣泛作用導(dǎo)致需求量較大，目前角鯊烯的來源有鯊魚肝臟、植物油、化學(xué)合成、生物合成等，并且絕大部分來源于鯊魚肝臟。所用角鯊烯提取純化方法主要有：超臨界萃取、分子蒸餾法、離子交換色譜法、反相色譜法、精餾法、冷凍結(jié)晶、高效逆流色譜法、兩相萃取、皂化、甲酯化、減壓蒸餾等多種方法組合。
[0010]中國專利CN102146014A的說明書中公開了一種以油茶籽為原料提取角鯊烯的工藝，其流程為備料、粉碎、浸提、濃縮、甲酯化反應(yīng)、配位劑
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硼砂反應(yīng)、大孔樹脂色譜分離純化、濃縮、萃取、洗滌、濃縮、得角鯊烯粗油和二氧化碳超臨界萃取，即得角鯊烯含量≥80%角鯊烯精油。中國專利CN113604512A的說明書中公開了一種從裂殖壺菌中提取角鯊烯的工藝，其流程為在發(fā)酵液中加入堿性蛋白酶，對裂殖壺菌進(jìn)行酶解破壁；在破壁后的菌液中加入無水乙醇，經(jīng)振蕩離心分離除去上清液水
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乙醇相，收集底層菌泥；在底層菌泥中加入正己烷，振蕩離心收集上清液，重復(fù)若干次，直到上清液無色透明，最后蒸發(fā)去除正己烷，收集得到角鯊烯粗品；將角鯊烯粗品進(jìn)行脫膠、脫酸、漂白和脫臭處理，得到純化的角鯊烯。上述兩種方式雖然都能夠獲得角鯊烯產(chǎn)品，但是工藝步驟比較繁瑣、工藝周期較長、所得角鯊烯純度相對較低、成本較高。
[0011]單從提取純度上來，現(xiàn)有技術(shù)雖然能夠獲得角鯊烯，純度也有過到96%，如上述專利中所公開一樣。但目前還沒有角鯊烯的提取純度為97%及以上的方法，且提取純度從96%提高到97%及以上是困難。因?yàn)楦鞣N角鯊烯來源宿主本身含有許多和角鯊烯性質(zhì)極為相似的物質(zhì)，通過多種方法都很難將其分開，方法條件極為苛刻，或成本極高無法大規(guī)模制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0012]為了解決以上技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，工藝簡單、回收率高和產(chǎn)品純度較高，純度上可在97%以上，且也可以達(dá)到100%的純度；并且避免了有機(jī)試劑的使用，大大節(jié)約了成本，綠色生態(tài)環(huán)保，極易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和推廣。
[0013]解決以上技術(shù)問題的本專利技術(shù)中的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，包括以下步驟：（1）釀酒酵母發(fā)酵液準(zhǔn)備；（2）離心后菌體洗滌：離心收集菌體，再加入蒸餾水重懸洗滌菌體，離心后再收集沉淀；（3）高壓均質(zhì)破碎：加入破碎提取液與沉淀混合，攪拌均勻后使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎；高壓均質(zhì)破碎提取，破碎效果好，提取效率高。
[0014]（4）兩相萃取旋蒸：充氮攪拌提取，取液相過濾后靜置分層，再取有機(jī)相組分進(jìn)行減壓蒸餾，去除有機(jī)溶劑得粗提物；加入正相平衡液溶解后即為正相樣品；正相色譜條件分離效果較好，回收率較高。
[0015]（5）柱層析和旋蒸：正相制備層析，按層析柱體積5
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10%比例上樣并分段收集各組分，檢測結(jié)果符合要求的目的組分混合后旋蒸去除有機(jī)試劑；檢測結(jié)果符合要求為GC檢測
純度大于97%；（6）除菌過濾即得。
[0016]所述步驟（3）中沉淀與破碎提取液的質(zhì)量體積比為1：1
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10。
[0017]優(yōu)化方案中沉淀與破碎提取液的質(zhì)量體積比為1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。
[0018]所述步驟（3）中破碎提取液為純化水和有機(jī)試劑的混合液，所述有機(jī)試劑為正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚，純化水和有機(jī)試劑按1：1或1：2或1：3或1：4或1:5比例進(jìn)行配制。破碎提取液能夠有效將目的物與其它水溶性雜質(zhì)分開。
[0019]所述步驟（4）中兩相萃取旋蒸具體為：充氮攪拌提取，取液相過濾后靜置分層，提取離心過濾上清加入旋蒸瓶減壓蒸餾，50
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60℃、50r/min旋4
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6min，優(yōu)化方案中55℃、50r/min旋5min，有機(jī)試劑全部旋出后得粗提物；加入二氯甲烷，混勻后加入純化水90ml，混勻后靜置分層，取下層二氯甲烷相加入旋蒸瓶中減壓蒸餾，50
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60℃、50r/min旋4
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6min，優(yōu)化方案中55℃、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）釀酒酵母發(fā)酵液準(zhǔn)備；（2）離心后菌體洗滌：離心收集菌體，加入蒸餾水重懸洗滌菌體，再離心收集沉淀；（3）高壓均質(zhì)破碎：加入破碎提取液與沉淀混合，充氮攪拌均勻后用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎；（4）兩相萃取旋蒸：充氮攪拌提取，取液相過濾后靜置分層，取有機(jī)相組分進(jìn)行減壓蒸餾，去除有機(jī)溶劑得粗提物；再加入正相平衡液溶解后即為正相樣品；（5）柱層析和旋蒸：選用正相制備層析，按層析柱體積5%
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10%比例上樣并分段收集各組分，檢測結(jié)果符合要求的目的組分混合后旋蒸去除有機(jī)試劑；（6）除菌過濾即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：所述步驟（3）中沉淀與破碎提取液的質(zhì)量體積比為1：1
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10；優(yōu)化方案中沉淀與破碎提取液的質(zhì)量體積比為1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：所述破碎提取液為純化水和有機(jī)試劑的混合液,所述有機(jī)試劑為正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚；優(yōu)化方案中，純化水和有機(jī)試劑按1：1或1：2或1：3或1：4或1:5比例進(jìn)行配制。4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：所述步驟（4）中正相平衡液為0.1
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99.9%正己烷
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99.9
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0.1%乙酸乙酯。5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：所述正相平衡液為99%正己烷
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1%乙酸乙酯。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：所述步驟（3）和步驟（5）的內(nèi)容替換為烘干菌體、超臨界萃取以及分子蒸餾步驟，具體為加入破碎液與沉淀混合，攪拌均勻后使用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎；破碎后的菌體干燥；干燥后所得干菌再依次經(jīng)二氧化碳超臨界萃取、過濾和分子蒸餾。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種生物合成角鯊烯的提取純化方法，其特征在于：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊立憲，劉騰飛，王海龍，劉洪波，劉曉滿，王雅君，何曉燕，李曉君，
申請(專利權(quán))人：北京華諾泰生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：