將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液和方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，由間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液和間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液組成。所述間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液由DMEM/F12培養(yǎng)基、KOSR血清替代物、谷氨酰胺和非必需氨基酸組成。所述間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液，由TGF

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液和方法


[0001]本專利技術(shù)涉及一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞間接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液和方法，屬于細胞分化


技術(shù)介紹

[0002]誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS細胞)，是指通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞。2006年日本京都大學(xué)Shinya Yamanaka在學(xué)術(shù)雜志《細胞》上率先報道了誘導(dǎo)多能干細胞的研究，他們把Oct3/4、Sox2、c
?
Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。
[0003]間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一種多能干細胞，首次分離于骨髓，后來在脂肪、臍帶和牙髓等部位均分離出此類成纖維樣形態(tài)的細胞。MSC具有成骨、成脂和成軟骨分化潛力，表達CD73、CD90、CD105等標志，但不表達HLA
?
DR，因此其具有低免疫型；另外MSC分泌許多細胞因子，在再生醫(yī)學(xué)和免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用；因此，多項Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗使用自體或異體MSC治療退行性疾病和自身免疫性疾病如神經(jīng)退行性疾病、缺血性心臟病、抗宿主移植(GVHD)疾病等。體外動物實驗和體內(nèi)臨床試驗也均表明移植的MSC可以歸巢至損傷或炎癥部位，通過細胞間接觸或旁分泌作用，促進細胞存活、損傷細胞修復(fù)或分化為功能性細胞。
[0004]多種成體組織來源的MSC已用于臨床試驗，但不同來源、不同培養(yǎng)方法甚至不同凍存條件都對細胞質(zhì)量和功能有影響。原代分離的MSC一般具有有限的增殖能力，長期培養(yǎng)后細胞的功能和分化潛力都受到影響，如骨髓來源MSC倍增時間約3.75天，可以擴增到10代左右；脂肪來源MSC倍增時間約1.6天，而臍帶來源MSC倍增時間更短，擴增能力也更強。除此之外，臍帶來源MSC具有更低的免疫原性和更強的免疫調(diào)節(jié)作用，且分泌更高的IL
?
6、IL
?
8等細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，不僅從不同組織來源如骨髓、脂肪和臍帶血分離獲取的MSC具有不同的生物學(xué)特性，而且從不同健康供體來源的骨髓MSC也具有不同的增殖能力和成骨分化潛能，這就導(dǎo)致MSC細胞治療臨床試驗中會產(chǎn)生不一致的數(shù)據(jù)。另外，不同年齡的供體所獲得的MSC質(zhì)量不同，年老供體由于細胞衰老、DNA損傷積聚以及代謝不穩(wěn)定等因素使得MSC擴增能力、分化潛能和臨床使用受限。早期研究采用將hESC和基質(zhì)細胞如OP9細胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)分化為MSC，但此方法培養(yǎng)時間久且誘導(dǎo)分化效率低；另外擬胚體(EB)方法也被用于MSC的誘導(dǎo)，如使用PDGF
?
AB和FGF2誘導(dǎo)分化的MSC細胞可經(jīng)流式分選后獲得；但這些方法不僅耗時而且效率不高，難以用于臨床試驗。目前尚未見到關(guān)于將誘導(dǎo)性多能干細胞誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0005]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，為克服獲得間充質(zhì)干細胞的方法耗時長、產(chǎn)量低的問題，本專利技術(shù)提供了一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液和方法。
[0006]本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007]一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，由間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液和間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液組成。
[0008]所述間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液，由DMEM/F12培養(yǎng)基、KOSR血清替代物、谷氨酰胺和非必需氨基酸(即NEAA，Thermor公司的商品化試劑)組成，其中，各組分的用量配比關(guān)系為：KOSR血清替代物占18％～22％(體積百分數(shù)，下同)，谷氨酰胺的濃度為0.8～1.2mM，非必需氨基酸的濃度為8～12mM，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0009]所述間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液，由TGF
?
β抑制劑和間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液組成，其中，TGF
?
β抑制劑的濃度為8～12μM，優(yōu)選10μM。
[0010]優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液中，各組分的用量配比關(guān)系為：KOSR血清替代物占20％，谷氨酰胺的濃度為1.0mM，非必需氨基酸的濃度為10mM，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0011]所述DMEM/F12培養(yǎng)基為常用的細胞培養(yǎng)基，可常規(guī)市場購買得到；所述KOSR血清替代物為常用的細胞培養(yǎng)添加劑，可常規(guī)市場購買得到。
[0012]所述TGF
?
β抑制劑選自SB431542，可常規(guī)市場購買得到；其可誘導(dǎo)干細胞向多方向細胞分化，包括內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等，；另外，其抑制ALK4/5/7的激活，SMAD2/3的磷酸化，并起始上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進而促進間充質(zhì)樣細胞的形成。
[0013]所述將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液在將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用。
[0014]一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的方法，包括以下步驟：
[0015](1)取誘導(dǎo)性多能干細胞，在37℃、5％CO2條件下，采用間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液定向分化培養(yǎng)10天，得培養(yǎng)液；定向分化培養(yǎng)期間每1～3天(優(yōu)選1天)更換一次培養(yǎng)液；
[0016](2)步驟(1)所得培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下，采用間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液培養(yǎng)3～5代，得間充質(zhì)干細胞；培養(yǎng)期間每2～4天(優(yōu)選2天)更換一次培養(yǎng)液。
[0017]本專利技術(shù)的培養(yǎng)液，采用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加有維持細胞生長必須的成分血清替代物、谷氨酰胺、非必需氨基酸，各組分定向起作用，可協(xié)同誘導(dǎo)iPSCs細胞定向分化為間充質(zhì)干細胞。培養(yǎng)液中含有特定的信號抑制劑，可以提高間充質(zhì)干細胞的純度和產(chǎn)量。
[0018]本專利技術(shù)的方法，可在較短時間內(nèi)將誘導(dǎo)性多能干細胞直接定向分化為間充質(zhì)干細胞。本專利技術(shù)以誘導(dǎo)性多能干細胞為起始，原材料數(shù)量不受限制，誘導(dǎo)性多能干細胞可以無限擴增，且避免了胚胎干細胞使用方面的道德爭議。培養(yǎng)周期為10左右，大大縮短了培養(yǎng)時間，降低了生產(chǎn)成本。本專利技術(shù)培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞使用的是無血清培養(yǎng)液，得到的間充質(zhì)干細胞可快速向臨床轉(zhuǎn)化。
附圖說明
[0019]圖1：iPS細胞的多能性鑒定結(jié)果示意圖。
[0020]圖2：各階段的細胞的形態(tài)示意圖。
[0021]圖3：P5代細胞、P10代細胞、P15代細胞的形態(tài)示意圖。
[0022]圖4：流式細胞鑒定結(jié)果示意圖。
具體實施方式
[0023]下面結(jié)合實施例對本專利技術(shù)作進一步的說明。然而，本專利技術(shù)的范圍并不限于下述實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在不背離本專利技術(shù)的精神和范圍的前提下，可以對本專利技術(shù)進行各種變化和修飾。
[0024]下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，其特征在于：由間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液和間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液組成；所述間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液，由DMEM/F12培養(yǎng)基、KOSR血清替代物、谷氨酰胺和非必需氨基酸組成，其中，各組分的用量配比關(guān)系為：KOSR血清替代物占18％～22％，谷氨酰胺的濃度為0.8～1.2mM，非必需氨基酸的濃度為8～12mM，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基；所述間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液，由TGF
?
β抑制劑和間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液組成，其中，TGF
?
β抑制劑的濃度為8～12μM。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，其特征在于：所述非必需氨基酸為Thermor公司的商品化試劑NEAA。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，其特征在于：所述TGF
?
β抑制劑選自SB431542。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，其特征在于：所述間充質(zhì)干細胞維持培養(yǎng)液中，各組分的用量配比關(guān)系為：KOSR血清替代物占20％，谷氨酰胺的濃度為1.0mM，非必需氨基酸的濃度為10mM，余量為DMEM/F12培養(yǎng)基。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液，其特征在于：所述間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)液中，TGF
?
β抑制劑的濃度為10μM。6.權(quán)利要求1～5中任一項所述的培養(yǎng)液在將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充質(zhì)干細胞中的應(yīng)用。7.一種將人誘導(dǎo)性多能干細胞直接誘導(dǎo)為間充...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉菲，張癸榮，張文華，謝斯坦，郭芳蕾，梁曉華，
申請(專利權(quán))人：銀豐生物工程集團有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：