一種利用乳酸乳球菌工程菌發酵生產大豆異黃酮的方法技術

本發明專利技術涉及一種大豆異黃酮的制備方法，尤其是公開了一種利用乳酸乳球菌工程菌發酵生產大豆異黃酮的方法，利用工程菌發酵底物產生異黃酮為大豆異黃酮的來源提供了新的途徑，而且克服了傳統大豆異黃酮工業受含量低和大豆原料本身的熟期限制。本發明專利技術所用的乳酸乳球菌為安全的食品級微生物，質粒ｐＮＺ８１４９以ＬａｃＦ基因取代了常用的抗生素抗性基因作為篩選標記，其宿主菌乳酸乳球菌ＮＺ３９００已刪除ｌａｃＦ基因，避免了抗生素抗性基因的水平轉移，更加安全，符合臨床應用要求，為將來工業開發利用工程菌代謝生產異黃酮開辟了應用前景。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種利用乳酸乳球菌工程菌發酵生產大豆異黃酮的方法，包括以下步驟：　　１）設計引物根據ＧｅｎＢａｎｋ已發表的大豆異黃酮合成酶基因ＩＦＳ１的ＤＮＡ序列，應用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０設計引物引物如下：　　上游引物：５′ＴＴ　ＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＧＣＴＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＴＴＴＧ　３′（ＳｐｅＩ）　　下游引物：５′ＴＴ　ＴＣＴＡＧＡ　ＴＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＧ　３′（ＸｂａＩ）　　２）提取大豆吉農１７的總ＲＮＡ，反轉錄成ＣＤＮＡ；３）擴增大豆異黃酮合成酶基因ＩＦＳ１，構建重組克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ－ＩＦＳ１并進行鑒定；　　４）構建含有ＩＦＳ１基因的重組表達載體為ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１，利用電穿孔方法將重組表達載體ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１轉入到乳酸乳球菌ＮＺ３９００中，獲得重組乳酸乳球菌工程菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１并進行鑒定；　　５）提取乳酸乳球菌工程菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１的粗蛋白，利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法對乳酸乳球菌工程菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１進行蛋白檢測；　　６）以大豆異黃酮之一染料木黃酮作為標準品，利用高效液相方法檢測工程菌發酵生產大豆異黃酮：　　利用乳酸乳球菌工程菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１發酵柚皮素產生大豆異黃酮；也可以應用含有柚皮素的自然添加物作為底物利用乳酸乳球菌工程菌ＮＺ３９００／ｐＮＺ８１４９－ＩＦＳ１發酵生產大豆異黃酮。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王丕武，劉洪禹，曲靜，王鑫雨，馬建，付永平，
申請(專利權)人：吉林農業大學，
類型：發明
國別省市：82[中國|長春]