分析細胞中蛋白質編碼變體的表達制造技術

本文提供了分析細胞中蛋白質編碼變體的表達。方法可包括用包括蛋白質編碼區的變體和鑒定該變體的第一條形碼的供體載體替換細胞中DNA的該蛋白質編碼區。該細胞可產生包括該變體的表達和該第一條形碼的表達的mRNA。對應于該細胞的第二條形碼可與mRNA偶聯。可將具有與其偶聯的該第二條形碼的mRNA逆轉錄成互補cDNA。可對cDNA進行測序。該供體載體或cDNA可使用擴增子測序進行測序。可將該供體載體序列和該cDNA序列關聯以鑒定該變體和該變體的細胞表達。胞表達。胞表達。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】分析細胞中蛋白質編碼變體的表達
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求以下申請的權益，這些申請中的每個申請的全部內容以引用方式并入本文中：
[0003]2021年3月9日提交的名稱為“Genomic library preparation and targeted epigenetic assays using Cas
?
gRNA ribonucleoproteins”的美國臨時專利申請號63/158,492；
[0004]2021年3月18日提交的名稱為“Genomic library preparation and targeted epigenetic assays using Cas
?
gRNA ribonucleoproteins”的美國臨時專利申請號63/162,775；
[0005]2021年3月19日提交的名稱為“Genomic library preparation and targeted epigenetic assays using Cas
?
gRNA ribonucleoproteins”的美國臨時專利申請號63/163,381；以及
[0006]2021年7月28日提交的名稱為“Analyzing Expression of Protein
?
Coding Variants in Cells”的美國臨時專利申請號63/226,424。


[0007]本申請涉及用于分析細胞中蛋白質編碼變體的組合物和方法。
[0008]關于序列表的聲明
[0009]與本申請相關聯的序列表以文本格式代替紙質副本提供，并且在此通過引用并入本說明書中。含有序列表的文本文件的名稱是8549103716_SL.txt。文本文件為約5.73KB、創建于2022年2月18日并且經由EFS
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Web以電子方式提交。

技術介紹

[0010]特異性表型測定已經被用于嘗試確定變體的功能或基因組編輯的效果，但是低通量的。例如，此類測定可提供關于僅單個變體或編輯的功能的信息，并且可不提供關于任何其它變體的功能的信息。單細胞RNA測序(scRNA
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seq)可商購獲得，并且可用于從細胞獲得轉錄組并對其進行測序。

技術實現思路

[0011]本文提供了分析細胞中蛋白質編碼變體的表達。
[0012]本文的一些示例提供了一種分析細胞中DNA的蛋白質編碼區的表達的方法。該方法可包括用包括該蛋白質編碼區的變體和鑒定該變體的第一條形碼的供體載體替換該細胞中DNA的該蛋白質編碼區。該細胞可產生包括該變體的表達和該第一條形碼的表達的mRNA。該方法可包括將對應于該細胞的第二條形碼與mRNA偶聯。該方法可包括將具有與其偶聯的該第二條形碼的mRNA逆轉錄成cDNA。該方法可包括對cDNA進行測序。該方法可包括使用擴增子測序對該供體載體或cDNA進行測序。該方法可包括將該供體載體序列和該cDNA
序列關聯以鑒定該變體和該變體的該細胞表達。
[0013]在一些示例中，該供體載體包括啟動子區。在一些示例中，該條形碼位于該啟動子區和該變體之間。在一些示例中，該供體載體包括右同源臂和左同源臂，該變體和該第一條形碼位于該右同源臂和該左同源臂之間。在一些示例中，該啟動子區包括反向啟動子區。在一些示例中，該反向啟動子區位于該第一條形碼和該變體之間。在一些示例中，該蛋白質編碼區的該變體的該表達是正向的，并且其中該第一條形碼的該表達是反向的。
[0014]附加地或另選地，在一些示例中，該方法進一步包括使用第一聚合酶鏈反應(PCR)過程來產生該供體序列的包括該變體、該第一條形碼和該右同源臂并且基本上排除該左同源臂的第一擴增子。該方法可包括使用第二PCR過程來產生該第一擴增子的包括該變體和該第一條形碼并且基本上排除該右同源臂和該左同源臂的第二擴增子。附加地或另選地，在一些示例中，對該供體載體進行測序包括對該第二擴增子進行測序。附加地或另選地，在一些示例中，該第二擴增子具有約1000個堿基或更少的長度。
[0015]附加地或另選地，在一些示例中，mRNA包括第一mRNA分子和第二mRNA分子，該第一mRNA分子包括該變體的該表達，該第二mRNA分子包括該第一條形碼的該表達。在一些示例中，將該第二條形碼與mRNA偶聯包括將該第二條形碼的第一分子與該第一mRNA分子偶聯；以及將該第二條形碼的第二分子與該第二mRNA分子偶聯。附加地或另選地，在一些示例中，cDNA包括第一cDNA分子和第二cDNA分子，該第一cDNA分子包括該變體和該第二條形碼的逆轉錄物，該第二cDNA分子包括該蛋白質編碼區和該第二條形碼的逆轉錄物，并且對cDNA進行測序包括對該第一cDNA分子和該第二cDNA分子進行測序。
[0016]附加地或另選地，在一些示例中，替換初始蛋白質編碼區包括使用CRISPR相關蛋白向導RNA核糖核蛋白(Cas
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gRNA RNP)切割該細胞中DNA；以及使用同源定向修復(HDR)來使用該供體載體修復DNA中的該切割。在一些示例中，該方法進一步包括將第一質粒和第二質粒插入到該細胞中。該供體載體可位于該第一質粒上。該細胞可使用該第二質粒表達該Cas
?
gRNA RNP。
[0017]附加地或另選地，在一些示例中，該供體載體包括慢病毒載體。
[0018]附加地或另選地，在一些示例中，該供體載體進一步包括嘌呤霉素抗性基因，該方法進一步包括使該細胞與嘌呤霉素接觸以富集該細胞。在一些示例中，該第一條形碼位于該嘌呤霉素抗性基因的UTR末端上。
[0019]附加地或另選地，在一些示例中，該方法進一步包括從該細胞中的該變體切割該第一條形碼。
[0020]本文的一些示例提供了一種分析細胞集合中的DNA的蛋白質編碼區的表達的方法。該方法可包括用包括該蛋白質編碼區的變體和鑒定該變體的第一條形碼的供體載體替換該細胞中的每一者中DNA的初始蛋白質編碼區。這些細胞可接受彼此不同的變體。該方法可包括從這些細胞獲得mRNA。來自每個細胞的mRNA可包括該細胞中該蛋白質編碼區的該變體的表達和該第一條形碼的表達。該方法可包括將對應于該細胞的第二條形碼與來自每個細胞的mRNA偶聯。該方法可包括將具有與其偶聯的該第二條形碼的mRNA逆轉錄成cDNA。該方法可包括對cDNA進行測序。該方法可包括使用擴增子測序對該供體載體或cDNA進行測序。該方法可包括將該供體載體序列和該cDNA序列關聯以鑒定這些細胞中的每一者中的該變體和該變體的該細胞表達。
[0021]在一些示例中，這些不同變體被飽和誘變。
[0022]本文的一些示例提供了一種細胞集合。該集合中的這些細胞中的每一者中的DNA可包括蛋白質編碼區的變體和鑒定該變體的第一條形碼。這些細胞可具有彼此不同的變體。
[0023]在一些示例中，這些不同變體被飽和誘變。
[0024]本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種分析細胞中DNA的蛋白質編碼區的表達的方法，所述方法包括：用包括所述蛋白質編碼區的變體和鑒定所述變體的第一條形碼的供體載體替換所述細胞中DNA的所述蛋白質編碼區，其中所述細胞產生包含所述變體的表達和所述第一條形碼的表達的mRNA；將對應于所述細胞的第二條形碼與mRNA偶聯；將具有與其偶聯的所述第二條形碼的mRNA逆轉錄成cDNA；對所述cDNA進行測序；使用擴增子測序對所述供體載體或cDNA進行測序；以及將所述供體載體序列和所述cDNA序列關聯以鑒定所述變體和所述變體的所述細胞表達。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述供體載體包括啟動子區。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述條形碼位于所述啟動子區和所述變體之間。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述供體載體包括右同源臂和左同源臂，所述變體和所述第一條形碼位于所述右同源臂和所述左同源臂之間。5.根據權利要求2或權利要求4所述的方法，其中所述啟動子區包括反向啟動子區。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述反向啟動子區設置在所述第一條形碼和所述變體之間。7.根據權利要求5所述的方法，其中所述蛋白質編碼區的所述變體的所述表達是正向的，并且其中所述第一條形碼的所述表達是反向的。8.根據權利要求4所述的方法，所述方法進一步包括：使用第一聚合酶鏈反應(PCR)過程來產生所述供體序列的包括所述變體、所述第一條形碼和所述右同源臂并且基本上排除所述左同源臂的第一擴增子；以及使用第二PCR過程來產生所述第一擴增子的包括所述變體和所述第一條形碼并且基本上排除所述右同源臂和所述左同源臂的第二擴增子。9.根據權利要求8所述的方法，其中對所述供體載體進行測序包括對所述第二擴增子進行測序。10.根據權利要求8所述的方法，其中所述第二擴增子具有約1000個堿基或更少的長度。11.根據權利要求1所述的方法，其中mRNA包括：第一mRNA分子，所述第一mRNA分子包括所述變體的所述表達，和第二mRNA分子，所述第二mRNA分子包括所述第一條形碼的所述表達。12.根據權利要求11所述的方法，其中將所述第二條形碼與所述mRNA偶聯包括：將所述第二條形碼的第一分子與所述第一mRNA分子偶聯；以及將所述第二條形碼的第二分子與所述第二mRNA分子偶聯。13.根據權利要求12所述的方法，其中所述cDNA包括第一cDNA分子和第二cDNA分子，所述第一cDNA分子包括所述變體和所述第二條形碼的逆轉錄物，所述第二cDNA分子包括所述蛋白質編碼區和所述第二條形碼的逆轉錄物，并且對所述cDNA進行測序包括對所述第一cDNA分子和所述第二cDNA分子進行測序。14.根據權利要求1所述的方法，其中替換起始蛋白質編碼區包括：
使用CRISPR相關蛋白向導RNA核糖核蛋白(Cas
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gRNARNP)切割所述細胞中DNA；以及使用同源定向修復(HDR)來使用所述供體載體修復DNA中的所述切割。15.根據權利要求14所述的方法，所述方法進一步包括將第一質粒和第二質粒插入到所述細胞中，其中所述供體載體位于所述第一質粒上；并且其中所述細胞使用所述第二質粒表達所述Cas
?
gRNA RNP。16.根據權利要求1所述的方法，其中所述供體載體包括慢病毒載體。17.根據權利要求1所述的方法，其中所述供體載體進一步包括嘌呤霉素抗性基因，所述方法進一步包括使所述細胞與嘌呤霉素接觸以富集所述細胞。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述第一條形碼位于所述嘌呤霉素抗性基因的UTR末端。19.根據權利要求1所述的方法，所述方法進一步包括從所述細胞中的所述變體切割所述第一條形碼。20.一種...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐紅霞，劉曈，肖詩敏，曹丹，V，
申請(專利權)人：伊魯米那股份有限公司，
類型：發明
國別省市：