一種酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶活性的方法及裝置制造方法及圖紙

本發明專利技術涉及聚合物敏感膜離子選擇性電極，具體的說是一種酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶活性的方法及裝置。以磁珠表面修飾的磷酸化自組裝多肽或其衍生物作為識別分子和信號傳導分子，堿性磷酸酶將識別分子和信號傳導分子去磷酸化，誘發識別分子和信號傳導分子并牽引磁珠團聚，使識別分子和信號傳導分子功能化磁珠在離子交換劑摻雜的聚合物膜電極上的電位響應改變，依據電位響應實現對堿性磷酸酶的定性和/或定量檢測。本發明專利技術中，多肽同時作為識別元件和指示離子，電極響應較快，操作簡單，在實際應用方面具有較好前景。實際應用方面具有較好前景。實際應用方面具有較好前景。

【技術實現步驟摘要】
一種酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶活性的方法及裝置


[0001]本專利技術涉及聚合物敏感膜離子選擇性電極，具體的說是一種酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶活性的方法及裝置。

技術介紹

[0002]多肽自組裝是多肽分子通過非共價鍵作用力包括疏水作用、范德華力、氫鍵、π
?
π堆積作用等聚集成有序的結構體如囊泡狀、柱狀、管狀、球狀和網狀等。由于催化環境溫和、易于實現疾病的診斷和治療等優點，生物酶催化短肽原位自組裝已被應用于靶點成像、腫瘤和細菌感染的診斷治療等多個領域。基于探針標記的自組裝多肽，研究者構建了多種生物傳感器，實現對酶、微生物等的定性及定量檢測。然而待測樣品中復雜基質對目標物的識別或響應信號的讀取產生一定的干擾，降低了目標物檢測的靈敏度。
[0003]堿性磷酸酶廣泛分布于人體各個部位，參與調節許多生物過程。堿性磷酸酶活性異常與多種疾病有關，如骨病、心血管疾病、癌癥、炎癥性疾病等。此外，堿性磷酸酶是海洋中廣泛存在的酶，主要由浮游植物、浮游動物、細菌產生。在缺磷的海區，分泌堿性磷酸酶是海洋微生物最主要的應對方式，即通過水解大分子溶解態有機磷為小分子無機磷緩解磷限制。堿性磷酸酶活性被認為是磷限制的重要指標。因此，開發靈敏度高、響應速度快的堿性磷酸酶檢測方法尤為重要。

技術實現思路

[0004]本專利技術的目的在于提供一種基于酶誘發多肽自組裝高靈敏檢測堿性磷酸酶活性的方法及裝置
[0005]為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為：
[0006]一種酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶的方法，以磁珠表面修飾的磷酸化自組裝多肽或其衍生物(多肽功能化磁珠)作為識別分子和信號傳導分子，堿性磷酸酶將識別分子和信號傳導分子去磷酸化，使其在離子交換劑摻雜的聚合物膜電極上產生電位響應，依據電位響應實現對堿性磷酸酶的定性和/或定量檢測；所述磷酸化自組裝多肽為FF
(x)
Y
(y)
EEE、FF
(x)
GEY
(y)
、FF
(x)
KY
(y)
或上述多肽中的衍生物，其中，磷酸化位點位于多肽分子中的酪氨酸(Y)上，x為苯丙氨酸(F)在多肽分子的數量，數量為1
?
4的正整數(1、2、3或4)，y為酪氨酸在多肽分子的數量，數量為1
?
2的正整數(1或2)。
[0007]上述記載磷酸化自組裝多肽在修飾于磁珠上時在自組裝多肽前可加入甘氨酸(G)用于間隔自組裝多肽序列與磁珠，減小自組裝位阻。
[0008]所述磷酸化自組裝多肽為FFFYYEEE，其中，序列中至少一個Y上磷酸化修飾；其在修飾于磁珠上時在自組裝多肽前可加入甘氨酸(G)用于間隔自組裝多肽序列與磁珠，減小自組裝位阻。
[0009]進一步的說，所述磷酸化多肽序列為GGGGGFFFYYEEE，其中，序列中兩個Y上磷酸化修飾，多肽通過固相合成法獲得，其狀態為多肽凍干粉，可配制為一定濃度的多肽溶液。
[0010]進一步的說，以磁珠表面修飾的磷酸化自組裝多肽或其衍生物作為堿性磷酸酶識別分子和信號傳導分子，待檢測樣品中含堿性磷酸酶使識別分子和信號傳導分子去磷酸化，使其親水性降低，誘發其進行自組裝并牽引磁珠團聚，在外加磁場作用下使其在離子交換劑摻雜的聚合物膜電極上產生電位響應，依據電位響應實現對堿性磷酸酶的定性和/或定量檢測。
[0011]所述識別分子和信號傳導分子去磷酸化，誘發其自組裝使磁珠團聚，導致在外加磁場作用下萃取或吸附至離子交換劑摻雜的聚合物膜電極的多肽數量變化，進而改變電位響應，依據電位響應實現對堿性磷酸酶的定性和/或定量檢測。
[0012]所述磁珠為二氧化硅或聚苯乙烯包裹的超順磁四氧化三鐵，其并與高純度鏈霉親和素共價結合，其中鏈霉親和素用于與生物素標記的多肽結合。
[0013]所述磷酸化自組裝多肽或其衍生物修飾于磁珠表面，具體是多肽或多肽衍生物經修飾固定在磁珠上；具體為：經氨基、羧基、氨基硫醇或生物素修飾的多肽與磁珠表面的羧基、氨基、巰基或鏈霉親和素相互作用，從而修飾于磁珠表面。
[0014]例如，兩端任意帶有氨基和/或羧基的多肽與羧基化(或氨基化)的磁珠進行反應，多肽固定于磁珠上；
[0015]C端修飾氨基硫醇的多肽與表面巰基化的的磁珠進行反應，多肽固定于磁珠上；
[0016]N端和/或C端經生物素(biotin)標記的多肽與鏈霉親和素修飾的磁珠進行反應,多肽固定于磁珠上；
[0017]多肽衍生物若其兩端任意帶有氨基和/或羧基與羧基化(或氨基化)的磁珠進行反應固定于磁珠上；
[0018]多肽衍生物若其C端修飾氨基硫醇的多肽與表面巰基化的的磁珠進行反應固定于磁珠上；等等。
[0019]所述磷酸化自組裝多肽及其衍生物包含酸性或堿性氨基酸，加入至特定緩沖溶液中帶有一定數量的正電荷或者負電荷，因此多肽功能化磁珠在特定緩沖溶液中同樣帶電荷；
[0020]所述離子交換劑摻雜的聚合物膜電極為電極底部粘附摻雜離子交換劑的聚合物膜，所述膜成分按重量份數計，20％
?
80％膜基體、20％
?
80％增塑劑，余量為離子交換劑；離子交換劑為陰離子交換劑或陽離子交換劑；其中，陰離子交換劑為三十二烷基甲基氯化銨、三十二烷基甲基氯化銨衍生物、三十四烷基甲基氯化銨或三十四烷基甲基氯化銨衍生物；陽離子交換劑為四(4
?
氯苯基)硼酸鉀、四(對甲苯基)硼酸鈉、四(3,5
?
二(三氟甲基)苯基)硼酸鈉、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸鹽或硼酸鹽或上述各化合物衍生物。
[0021]膜基體為聚氯乙烯，聚丁基丙烯酸酯，聚醚酰亞胺，橡膠或溶膠凝膠膜；增塑劑為鄰硝基苯辛醚，二
?2?
乙基己基癸酯，癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；
[0022]一種所述的酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶的方法采用的裝置，裝置包括電化學檢測池、指示電極、參比電極、電化學外部測量裝置和外部磁場；所述指示電極、參比電極一端分別插入至電化學檢測池，另一端分別通過導線與電化學外部測量裝置相連接，外部磁場置于電化學檢測池的下方；其中，所述指示電極為離子交換劑摻雜的聚合物膜電極。
[0023]所述外部磁場可以為小型圓柱狀磁鐵、平板磁鐵或電磁鐵。
[0024]所述聚合物膜電極可以為傳統的內充液式聚合物敏感膜電極、新型固態電極或印
刷電極。其中，印刷電極的指示電極可以為聚合物敏感膜覆蓋的碳電極，參比電極可以為銀
?
氯化銀電極。
[0025]所述指示電極為單電極或電極陣列。
[0026]所述的電化學外部測量裝置為電化學工作站、離子計或電位儀。
[0027]所述參比電極可以為飽和甘汞電極、銀
?
氯化銀電極；輔助電極可以為鉑絲。
[0028]一種所述方法的應用，所述方法在檢測環境中堿性磷酸酶中的應用。
[0029]利用所述方法在細菌表面堿性磷本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于：以磁珠表面修飾的磷酸化自組裝多肽或其衍生物作為識別分子和信號傳導分子，堿性磷酸酶將識別分子和信號傳導分子去磷酸化，誘發識別分子和信號傳導分子并牽引磁珠團聚，使識別分子和信號傳導分子功能化磁珠在離子交換劑摻雜的聚合物膜電極上的電位響應改變，依據電位響應實現對堿性磷酸酶的定性和/或定量檢測；所述磷酸化自組裝多肽為FF
(x)
Y
(y)
EEE、FF
(x)
GEY
(y)
、FF
(x)
KY
(y)
或上述多肽中的衍生物，其中，磷酸化位點位于多肽分子中的酪氨酸(Y)上，x為苯丙氨酸(F)在多肽分子的數量，數量為1
?
4的正整數，y為酪氨酸在多肽分子的數量，數量為1
?
2的正整數。2.按權利要求1所述的酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于：以磁珠表面修飾的磷酸化自組裝多肽或其衍生物作為堿性磷酸酶識別分子和信號傳導分子，待檢測樣品中堿性磷酸酶對磷酸化自組裝多肽或其衍生物去磷酸化，使其親水性降低，誘發其進行自組裝并牽引磁珠團聚，在外加磁場作用下使其在離子交換劑摻雜的聚合物膜電極上產生電位響應，依據電位響應實現對堿性磷酸酶定性和/或定量的檢測。3.按權利要求1所述的酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于：所述磷酸化自組裝多肽為FFFYYEEE，其中，序列中至少一個Y被磷酸化修飾。4.按權利要求1
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3任意一項所述的酶誘發多肽自組裝檢測堿性磷酸酶的方法，其特征在于：所述識別分子和信號傳導分子去磷酸化，誘發其自組裝使磁珠團聚，導致在外加磁...

【專利技術屬性】
技術研發人員：丁家旺，張晗，秦偉，
申請(專利權)人：中國科學院煙臺海岸帶研究所，
類型：發明
國別省市：