本發明專利技術涉及基因檢測領域，具體涉及基于數字PCR技術的聯合檢測試劑盒。本發明專利技術提供了基于數字PCR技術的聯合檢測試劑盒。本發明專利技術靈敏度高，通量高，對各弓形蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對各肝吸蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對各肺吸蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對各旋毛蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對日本血吸蟲核酸的檢測靈敏度可達10copies/測試。測靈敏度可達10copies/測試。
【技術實現步驟摘要】
基于數字PCR技術的聯合檢測試劑盒
[0001]本專利技術涉及基因檢測領域，具體涉及基于數字PCR技術的聯合檢測試劑盒。
技術介紹
[0002]弓形蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲、日本血吸蟲在世界范圍內廣泛傳播的人獸共患寄生蟲病。
[0003]弓形蟲病是由機會性胞內寄生蟲剛地弓形蟲所引起的。這種寄生蟲可以入侵所有的溫血動物，包括人類。免疫力正常的機體不會表現出明顯癥狀，在免疫力低下的人群中會導致腦積水、視網膜脈絡膜炎、腦炎，在免疫力系統損傷的人群中甚至會引起死亡。弓形蟲病同時也對畜禽養殖業造成了重大的影響，它可以造成畜禽的流產、死胎以及新生幼畜的死亡，尤其是在綿羊和山羊之中。因此，弓形蟲病在公共衛生學以及畜禽安全生產上的地位十分重要。
[0004]弓形蟲病的診斷目前主要依靠血清學檢測方法，乳膠凝集試驗(LAT)是在畜禽中檢測弓形蟲的主要方法，但該方法的特異性較低。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是診斷人弓形蟲病的最主要方法。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是診斷人弓形蟲病的最主要方法。但這些方法都需要較長的時間，而且需要一些設備或者受過專業訓練的技術人員，不適于大規?，F場檢測。
[0005]肺吸蟲病主要是肺吸蟲蟲體(幼蟲或成蟲)在人體組織與器官內移行、寄居造成的機械性損傷，及其代謝物等引起的免疫病理反應。在我國，致病蟲種主要為衛氏肺吸蟲和斯氏肺吸蟲，其成蟲寄生于人、犬、果子貍等肉食動物的肌肉和器官如肝、肺中；目前，用于肺吸蟲病的免疫學檢測方法種類較多，包括抗體檢測方法如皮內試驗(IT)、補體結合試驗(CFT)、間接血凝試驗(IHA)、對照免疫電泳試驗(CIEP)、免疫熒光試驗(IFAT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等；以及抗原檢測方法如多克隆或單克隆抗體ELISA法等。抗體檢測方法敏感性高，但因治愈后抗體在體內仍可維持較長時間，致使療效考核效果不理想，尤其在疫區反復感染人群中無法區別是現行感染還是既往感染。
[0006]現在所使用的標準檢查法是顯微鏡蟲卵糞便檢查法。一條肝吸蟲成蟲一天所產下的蟲卵數量大約在100個左右。對肝吸蟲蟲體的負荷較低的感染者的情況下，顯微鏡蟲卵糞便檢查法的蟲卵檢測率會降低，從而需要進行反復檢查，因此，具有糞便檢查所需時間過長的缺點。并且，還具有患者不愿意采取和提出診斷用糞便的問題和在解讀寄生蟲蟲卵方面需要熟練的專業人員的問題。除此之外，還補充利用血清學抗體檢查、超聲波檢查法、內視鏡逆行性膽道照影術及皮內反應檢查法。血清抗體檢查法將肝吸蟲粗蛋白用作抗原，雖然靈敏度高，但特異度低。粗抗原蛋白對肝吸蟲感染者的血清實施免疫印跡(immunoblotting)，即，酶聯免疫吸附測定法(ELISA)的結果表明，雖然靈敏度高，但特異度低，因交叉反應，不適合用作鑒別診斷寄生蟲感染的抗原蛋白質。肝吸蟲粗抗原為了改善與其他寄生蟲感染者的血清進行交叉反應的非特異性陽性反應，需要解決研發一種特異度和靈敏度都優秀的單一抗原蛋白質的難題。
[0007]旋毛蟲病(trichinosis，trichinellosis)是由旋毛線蟲(Trichinellaspiralis)引起的人畜共患的寄生蟲病，流行于哺乳類動物間，人因生食或半生食含旋毛蟲包囊的豬肉等而感染。臨床表現為胃腸道癥狀、發熱、肌痛、水腫和血嗜酸粒細胞增多等。我國自1881年在廈門發現旋毛蟲病以來，目前已有26個省(市、區)有關于旋毛蟲病流行的報道。臨床上，旋毛蟲病確診主要靠檢測病原和實驗室檢查和DNA檢測法。
[0008]日本血吸蟲(SchistosomajaponicumKatsurada，1904)即血吸蟲，又稱裂體吸蟲。血吸蟲病是由血吸蟲寄生于人體引起的地方性寄生蟲病。寄生于人體的血吸蟲主要有三種:即流行于非洲北部的埃及血吸蟲；流行于拉丁美洲及非洲中部的曼氏血吸蟲以及流行于亞洲的日本血吸蟲。此外，還有間插血吸蟲、湄公血吸蟲可以寄生人體。在我國因只有日本血吸蟲病流行，故通常將日本血吸蟲病簡稱為血吸蟲病。
[0009]目前沒有可以聯合檢測以上病原體的技術。
技術實現思路
[0010]有鑒于此，本專利技術提供了基于數字PCR技術的聯合檢測試劑盒。
[0011]本專利技術提供了基于數字PCR技術的聯合檢測試劑盒。本專利技術靈敏度高，通量高，對各弓形蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對各肝吸蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對各肺吸蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對各旋毛蟲核酸的檢測靈敏度可達5copies/測試、對日本血吸蟲核酸的檢測靈敏度可達10copies/測試。
[0012]為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
[0013]本專利技術提供了多重檢測的引物探針組合，包括：
[0014](Ⅰ)、引物具有如SEQ ID No.1～2、4～5、7～8、10～11、13～14任意所示的核苷酸序列；和
[0015](Ⅱ)、探針具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15任意所示的核苷酸序列；或
[0016](Ⅲ)、與(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0017](Ⅳ)、與(Ⅰ)～(Ⅲ)任一項所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
[0018]在本專利技術的一些具體實施方案中，所述引物探針組合，包括：
[0019]用于檢測弓形蟲的引物探針的組合：
[0020]所述引物具有如SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；和
[0021]所述探針具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
[0022]用于檢測日本血吸蟲的引物探針的組合：
[0023]所述引物具有如SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列；和
[0024]所述探針具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
[0025]用于檢測肝吸蟲的引物探針的組合：
[0026]所述引物具有如SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列；和
[0027]所述探針具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
[0028]用于檢測肺吸蟲的引物探針的組合：
[0029]所述引物具有如SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；和
[0030]所述探針具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；
[0031]用于檢測旋毛蟲的引物探針的組合：
[0032]所述引物具有如SEQ ID No.13～14所示的引物；和
[0033]所述探針具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
[0034]在本專利技術的一些具體實施方案中，所述弓形蟲的基因具有：
[0035](Ⅰ)、如SEQ ID NO.19所示核苷酸序列；或
[0036](Ⅱ)、與(Ⅰ)所示的核苷酸序列編碼相同蛋白質，但因遺傳密碼的簡并性而與(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.多重檢測的引物探針組合，其特征在于，包括：(Ⅰ)、引物具有如SEQ ID No.1～2、4～5、7～8、10～11、13～14任意所示的核苷酸序列；和(Ⅱ)、探針具有如SEQ ID No.3、6、9、12、15任意所示的核苷酸序列；或(Ⅲ)、與(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個核苷酸序列獲得的核苷酸序列，且與(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(Ⅳ)、與(Ⅰ)～(Ⅲ)任一項所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。2.如權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，包括：用于檢測弓形蟲的引物探針的組合：所述引物具有如SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；和所述探針具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；用于檢測日本血吸蟲的引物探針的組合：所述引物具有如SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列；和所述探針具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；用于檢測肝吸蟲的引物探針的組合：所述引物具有如SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列；和所述探針具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；用于檢測肺吸蟲的引物探針的組合：所述引物具有如SEQ ID No.10～11所示的核苷酸序列；和所述探針具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；用于檢測旋毛蟲靶的引物探針的組合：所述引物具有如SEQ ID No.13～14所示的引物；和所述探針具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。3.如權利要求1或2所述的引物探針組合，其特征在于，所述探針的5
’
端標記熒光報告基團，3
’
端標記淬滅基團MGB；所述熒光報告基團包括FAM、VIC、ROX、Cy5和/或A425。4.如權利要求1至3任一項的所述的引物探針組合，其特征在于，SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的探針的5
’
端標記熒光報告基團為FAM，3
’
端標記淬滅基團為MGB；SEQ ID No.6所示核苷酸序列的探針的5
’
端標記熒光報告基團為VIC，3
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端標記淬滅基團為MGB；SEQ ID No.9所示核苷酸序列的探針的5
’
端標記熒光報告基團為ROX，3
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【專利技術屬性】
技術研發人員：夏江，位玉玲，
申請(專利權)人：領航基因科技杭州有限公司，
類型：發明
國別省市：
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