本發明專利技術屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體為一種人類真核翻譯延伸因子ｅＥＦ１α１基因工程菌。包括該延伸因子的克隆載體構建，延伸因子蛋白的重組質粒構建，基因工程表達菌株及其表達形式分析與純化方法等。其中基因工程表達菌株為大腸桿菌ＤＨ５α、ＢＬ２１或Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ中的任意一種，重組質粒為含ｅＥＦ１α１基因的質粒ｐＥＴ２２ｂ（＋）。本發明專利技術提供的基因工程菌可用于生產可溶的ｅＥＦ１α１蛋白，具有表達量高、成本低，表達獲得的重組人ｅＥＦ１α１融合蛋白有酶學活性和免疫學活性，純化步驟簡便，易于操作，得率高等特點；該重組蛋白可用于外源標記的蛋白功能研究，或用于抗原免疫動物研究與該蛋白相關的免疫研究，或作為蛋白標準品的應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學、基因工程
，具體涉及一種含有人類真核翻譯延 伸因子(eEFla 1 )的克隆載體構建，表達人類真核翻譯延伸因子(eEFl a 1)蛋白的重組質 粒構建、基因工程表達菌株，蛋白質表達形式分析與兩種純化方法比較。
技術介紹
人類真核翻譯延伸因子lA(eEFl a )是一個主要的翻譯因子，eEFl a GTP催化 氨酰tRNA結合到核糖體的A位點。eEFl a不僅僅是翻譯必須的蛋白，而且是一個重要的 多功能蛋白。eEFl a參與許多重要的細胞過程和疾病，包括信號傳導、翻譯控制、凋亡、細 胞骨架組成、病毒復制及癌基因轉化等。該基因在人類許多腫瘤如結腸癌，膀胱癌，子宮頸 癌，乳腺癌中含量很高，而在其對應的正常組織中表達量很少。體外表達eEFla 1蛋白，對 于研究其與凋亡相關的蛋白P53和骨架蛋白的關系有重大意義，作為長壽藥物的開發也有 廣泛的前景。
技術實現思路
本專利技術的目的在于通過構建人類真核翻譯延伸因子(eEFla 1 )蛋白的重組質粒， 并采用基因工程表達菌表達出可溶性的eEFl a 1融合蛋白，使其具有表達量高、成本低的 特點，并且使表達獲得的重組人eEFl a 1融合蛋白有酶學活性和免疫學活性，純化步驟簡 便，易于操作，得率高，為人類真核翻譯延伸因子在體外的功能研究提供很好的基礎。本專利技術首先從人胎肝總RNA中反轉錄擴增出人類真核翻譯延伸因子eEFl a 1。本專利技術還構建分泌性表達eEFl a 1基因的重組質粒pet22b (+) -A,并利用轉化基 因工程表達菌株，成功獲得分泌性表達eEFl a 1蛋白的基因工程菌。具體而言，該基因工程 菌的構建方法包括設計RT-PCR上游和下游引物，從人胎肝總RNA中反轉錄擴增a 1基 因編碼序列，克隆到T載體以及成功構建eEFl a 1重組分泌表達質粒pet22b_A，并通過表 達載體轉化到大腸桿菌獲得高效分泌重組人eEFl a 1的基因工程菌。本專利技術還成功表達出高純度、高產量的6His tagged eEFl a 1蛋白及其鑒定。本專利技術還提供一種新穎的eEFl a 1分泌表達與包涵體表達兩種表達形式的分析 與判斷方法。即分別在37°C，30°C和25°C條件下，SDS-PAGE分析誘導表達菌的包涵體與胞 漿蛋白組分，進而確定最優分泌性表達條件和最優包涵體表達條件。本專利技術還提供His-Trap親和層析柱純化高純度eEFl a 1蛋白的方法。即含20mM 咪唑Binding buffer與含500mM咪唑Elution buffer線性洗脫的方法。本專利技術還提供該基因工程菌表達并純化出的蛋白的Mass spectrum結果，結果表 明其為人類翻譯延伸因子eEFl a 1。因此上述工作，本專利技術提供了一種含有站7全長編碼基因的重組pUcm-T載 體克隆質粒，以及包含此重組質粒的克隆菌株XLl-Blue。本專利技術還提供了一種含有eEFl a 1全長編碼基因的重組表達質粒pet22b(+)_A，以及包含此重組質粒的表達菌株BL21(DE3)。重組質粒pet22b(+)-A的基因序列見SEQ ID NO. 2。本專利技術還提供了一種基因工程菌表達出的eEFl a 1蛋白，其N末端有6XHis蛋 白，與eEFl a 1 (462個氨基酸殘基)形成融合蛋白，利用His-Trap親和純化，eEFl a 1蛋 白分子量為49. 8kD，等電點為9. 1 ；其融合蛋白分子量為50. 5kDa，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3。本專利技術還提供了一種用于分析和判斷eEFl a 1蛋白表達形式的方法，其關鍵在 于，根據不同溫度下IPTG誘導的重組表達菌株包涵體與胞漿成分分析，圖片如圖3所示。本專利技術還提供了一種得到高純度6His Tagged-eEFl a 1蛋白的His-Trap親和層 析純化方法，蛋白純化前后結果SDS-PAGE電泳分析如圖4，純化后蛋白Western Blot鑒定 圖片如圖5。本專利技術還提供了一種用于該融合蛋白的質譜分析，其結果表明該蛋白為人類翻譯 延伸因子eEFl a 1蛋白。本專利技術提供的基因工程菌分泌表達出的eEFl a 1蛋白，可應用于外源標記的蛋白 功能研究，也可作為抗原免疫動物研究與該蛋白相關的免疫研究，也可以作為蛋白標準品等應用。附圖說明圖1為pet22b-eEFlAl重組質粒示意圖。圖2為eEFlAl基因PCR擴增產物、菌液PCR和雙酶切鑒定電泳圖。圖3為不同溫度下重組表達菌株包涵體與胞漿成分SDS-PAGE分析圖。圖4為重組蛋白純化前后SDS-PAGE電泳分析圖。圖5為純化后蛋白SDS-PAGE分析與Western Blot鑒定圖。圖6為Bradford法蛋白測定BSA標準曲線。圖7為重組蛋白質譜可能Mowse分數圖。圖8為重組蛋白質譜中最大Mowse分數蛋白解讀圖。具體實施例方式下面結合具體實施實例進一步闡釋本專利技術。應理解，這些實例僅以用于說明本發 明而不用于限制本專利技術的范圍。下列實例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法 進行。如 Sambrook 等分子克隆實驗手冊(New York: Cold Spring Harbor Labortary Press, 1989)中所述條件，或按照制造生產廠商的使用說明。實施例1人類真核翻譯延伸因子lA(eEFl a 1)基因的克隆。1人胎肝總RNA從上海申能博采生物有限公司購買，保存在-20°C。反轉錄試劑盒 從TaKaRa公司購買，保存于_20°C。2基因克隆從人胎肝總RNA中反轉錄(RT-PCR)擴增人胎肝cDNA，以逆轉錄的 cDNA第一鏈為模板，利用正向引物和反向引物進行PCR，獲得eEFl a 1編碼基因全長，并成 功克隆pUCm-T-A重組質粒(克隆菌株為XLl-Blue)。4實施例2含目的基因eEFl a 1表達載體的構建。1根據人類真核翻譯延伸因子eEFl a 1基因全長編碼序列，設計擴增出完整編碼 閱讀框的引物，并在正反向引物A1，A2上分別引入限制性內切酶識別位點(引物序列見SEQ ID NO. 1)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的pUCm-T-A質粒為模板，在5’端和3’端 分別加入Afcol和及酶切位點，構成重組質粒圖如圖1。經和Afcol私BamHl雙酶切的PCR 產物與經過同樣雙酶切的pet22b (+)原核表達載體連接，YC法轉化，重組質粒pet22b (+) -A 的PCR與酶切雙重鑒定后的陽性克隆，送上海生工測序，確保開放讀框正確。PCR擴增產物 電泳圖片、菌液PCR和雙酶切鑒定結果見圖2. A, B, C，重組質粒pet22b (+) -A的基因序列見 SEQ ID NO. 2。實施例3eEFl a 1基因工程菌的獲得。用YC法將實施例2中重組表達質粒pet22b(+)_A轉化到原核表達菌株五coil BL21(DE3)中，經轉化子鑒定后獲得基因工程菌。YC法感受態細胞制備(實驗室建立此方法)1、LBmedium 至 0D 為 0. 4 ；2、4°C , 6000rpm, 5min，棄上清收菌；3、重懸于原培養體積1/10的TSB中；4、冰置10分鐘，分裝為每管50ul，-80°C凍存待用。YC法轉化(實驗室建立此方法)1、pe本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱乃碩，魏勛斌，郭艷榮，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：31
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