一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于茶樹種質(zhì)鑒定利用與新品種選育領(lǐng)域，具體涉及一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的dCAPS標(biāo)記引物及方法


[0001]本專利技術(shù)屬于茶樹種質(zhì)鑒定利用與新品種選育領(lǐng)域，具體涉及一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的
dCAPS
標(biāo)記引物及方法
。

技術(shù)介紹

[0002]揮發(fā)性萜烯醇是構(gòu)成茶葉花香的重要組分，是茶葉中一類重要的次生代謝物質(zhì)，該類物質(zhì)在茶樹體內(nèi)合成后，少部分以游離態(tài)存在，絕大多數(shù)與單糖
、
二糖等結(jié)合形成糖苷的形式存在于茶鮮葉細(xì)胞液泡中
。
揮發(fā)性萜醇與糖結(jié)合后，水溶性增大，穩(wěn)定性增強，生物活性降低
。
糖苷的存在，一方面可能是有利于其在體內(nèi)運輸，另一方面可能是以一種低毒或脫毒的形式避免其苷元對植物自身造成毒害
。
在茶葉加工過程中，茶葉細(xì)胞會遭受破會，體內(nèi)積累的糖苷會與內(nèi)源糖苷酶充分接觸，并在內(nèi)源糖苷酶的作用下水解，釋放出揮發(fā)性萜烯醇，從而使茶葉表現(xiàn)出愉悅的花香
。
[0003]香葉醇是茶樹中含有的一種重要的揮發(fā)性單萜烯醇，具有溫和
、
甜蜜的玫瑰花香，是茶葉中的關(guān)鍵呈香成分之一
。
茶鮮葉中的香葉醇主要以香葉醇櫻草糖苷形式存在，在紅茶揉捻和發(fā)酵過程中，葉細(xì)胞會發(fā)生破碎，香葉醇櫻草糖苷會在內(nèi)源糖苷酶的水解下產(chǎn)生大量的香葉醇，這正是高品質(zhì)紅茶具有愉悅玫瑰花香的重要原因
。
[0004]傳統(tǒng)方法在篩選花香型茶樹種質(zhì)時采用的是直接鑒定法，該方法首先需要擴繁待鑒定的茶樹種質(zhì)獲得一定數(shù)目的茶苗，然后定植茶苗，待定植茶苗正常生長至可開采樹齡，采摘茶鮮葉制作茶葉，最后根據(jù)感官審評結(jié)果判定該種質(zhì)是否屬于花香型茶樹種質(zhì)，該方法鑒定結(jié)果易受栽培
、
加工等多重因素影響，需要重復(fù)鑒定
。
直接鑒定法從種植茶樹到獲得鑒定結(jié)果往往需要多年
(
至少5～6年
)
，存在鑒定周期長，鑒定程序復(fù)雜，需要耗費大量的人力
、
物力及財力的缺點
。
[0005]分子標(biāo)記輔助育種是利用分子標(biāo)記與決定目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子標(biāo)記，即可檢測到目的基因的存在，達(dá)到選擇目標(biāo)性狀的目的，具有快速
、
準(zhǔn)確
、
不受環(huán)境條件干擾的優(yōu)點
。
分子標(biāo)記輔助育種可以縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，提高育種效率，彌補傳統(tǒng)常規(guī)育種方法的缺點
。
我們基于簡化基因組測序技術(shù)
(SLAF
?
seq)
及全基因組關(guān)聯(lián)分析法
(GWAS)
在茶樹基因組
(http://tpia.teaplants.cn)
的
Scaffold349
上鑒定到6個
SNP
位點與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)
(
堿基位置分別為
3542803、3543009、3543014、3543021、3543061、3543082)
，當(dāng)6個
SNP
位點基因型分別為
A、A、A、T、T、A
時，其對應(yīng)的種質(zhì)為香葉醇櫻草糖苷高含量種質(zhì)，當(dāng)6個
SNP
位點基因型分別為
G、G、G、G、C、G
時，其對應(yīng)的種質(zhì)為香葉醇櫻草糖苷低含量種質(zhì)
。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)段
8.6kb
區(qū)域附近存在1個異戊烯基二磷酸合酶基因
(TEA023826.1)
，該酶正是催化異戊烯基焦磷酸
(IPP)
與其異構(gòu)體二甲丙烯焦磷酸
(DMAPP)
生成香葉基焦磷酸
(GPP)
的關(guān)鍵酶，該步驟也是茶樹體內(nèi)合成香葉醇的關(guān)鍵步驟
。
此外，在該區(qū)段
10.9kb
和
85.8kb
附近區(qū)域分別存在1個核糖體蛋白基因
(TEA023811.1)
和1個
RNA
聚合酶
II
轉(zhuǎn)錄亞基基因
(TEA023801.1)
，轉(zhuǎn)錄組測序表明這2個基
因在極端高含量香葉醇櫻草糖苷和極端低含量香葉醇櫻草糖苷材料中均表現(xiàn)顯著差異表達(dá)
。
上述3個基因均處在6個
SNP
變異區(qū)段的
LD
區(qū)間內(nèi)
(3
個基因與6個
SNP
位點存在連鎖不平衡
)
，推測基因
TEA023811.1
和基因
TEA023801.1
極有可能參與了異戊烯基二磷酸合酶基因
TEA023826.1
的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而導(dǎo)致了香葉醇櫻草糖苷代謝和累積的變化
。
[0006]基于上述發(fā)現(xiàn)，我們利用
Scaffold349
上的6個
SNP
變異區(qū)段附近
320bp
的
DNA
序列設(shè)計了1對
dCAPS
標(biāo)記引物，利用該引物對不同茶樹種質(zhì)進(jìn)行
DNA
基因型分析，根據(jù)分型結(jié)果即可將香葉醇櫻草糖苷含量高的茶樹種質(zhì)篩選出來
。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0007]本專利技術(shù)的目的在于提供一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的
dCAPS
標(biāo)記引物及方法
。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：一種用于快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的
dCAPS
標(biāo)記引物，所述
dCAPS
標(biāo)記引物核苷酸序列為：上游引物：5’?
TCGTGTGGCCTCAATTGCCT
?3’
，下游引物：5’?
ACACCGACAAATGTGACAGA
?3’
。
[0009]上述一種
dCAPS
標(biāo)記引物在篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)中的應(yīng)用
。
[0010]一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的分子標(biāo)記方法，其包括以下步驟：
1)
提取待測茶樹種質(zhì)的葉片基因組
DNA
；
2)
以提取的葉片基因組
DNA
為模板，用
dCAPS
標(biāo)記引物進(jìn)行
PCR
擴增，得到
PCR
產(chǎn)物；
3)
利用限制性內(nèi)切酶
MfeⅠ酶切
PCR
產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物；
4)
將酶切產(chǎn)物進(jìn)行
1.0
％瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳圖譜；
5)
將待測茶樹種質(zhì)電泳圖譜與香葉醇櫻草糖苷高含量茶樹種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜比較，如果圖譜一致，則判定該待測茶樹種質(zhì)為高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)；所述
dCAPS
標(biāo)記引物核苷酸序列為：上游引物：5’?<本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
1.
一種用于快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的
dCAPS
標(biāo)記引物，其特征在于：所述
dCAPS
標(biāo)記引物核苷酸序列為：上游引物：5’?
TCGTGTGGCCTCAATTGCCT
?3’
，下游引物：5’?
ACACCGACAAATGTGACAGA
?3’
。2.
如權(quán)利要求1所述的
dCAPS
標(biāo)記引物在篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)中的應(yīng)用
。3.
一種快速篩選高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)的分子標(biāo)記方法，其特征在于：包括以下步驟：1）提取待測茶樹種質(zhì)的葉片基因組
DNA
；2）以提取的葉片基因組
DNA
為模板，用
dCAPS
標(biāo)記引物進(jìn)行
PCR
擴增，得到
PCR
產(chǎn)物；3）利用限制性內(nèi)切酶
Mfe
?Ⅰ
酶切
PCR
產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物；4）將酶切產(chǎn)物進(jìn)行
1.0%
瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳圖譜；5）將待測茶樹種質(zhì)電泳圖譜與香葉醇櫻草糖苷高含量茶樹種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜比較，如果圖譜一致，則判定該待測茶樹種質(zhì)為高含量香葉醇櫻草糖苷茶樹種質(zhì)；所述
dCAPS
標(biāo)記引物核苷酸序列為：上游引物：5’?
TCGTGTGGCCTCAATTGCCT
?3’
，下游引物：5’?
ACACCGACAAATGTGACAGA
?3’
。4.
根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記方法，其特征在于：所述
PCR
擴增的反應(yīng)體系為：
ddH2O 16
μ
L
，

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王讓劍，楊軍，張力嵐，高香鳳，
申請(專利權(quán))人：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：