檢測含有基因ＣｒｙＩＡｃ的轉基因植物及產品的基因芯片及其應用制造技術

本發明專利技術公開了檢測含有基因ＣｒｙＩＡｃ的轉基因植物及產品的基因芯片，包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的探針以及核酸固定的陽性對照（ＨＥＸ）、雜交陽性對照（ＰＣ）、陽性質控探針（１８ＳｒＲＮＡ）、陰性質控探針、空白對照；所述的基因特ＣｒｙＩＡｃ的探針序列為：ＮＨ２－（ＣＨ２）６－Ｏ－Ｐｏｌｙ（ｄＴ）１５－ＴＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＣ?ＣＴＡＣＴＡＡＣＣ?ＣＡＧ?ＣＴＣＴＣＣＧ。本發明專利技術的檢測含有基因ＣｒｙＩＡｃ的轉基因植物及產品的基因芯片，具有很好的特異性，靈敏度高，為含有基因ＣｒｙＩＡｃ的轉基因植物及其產品的特異性檢測分析提供了基于簡單、可靠的測定方法，可以用于轉基因植物及其產品的檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種檢測含有基因CryIAc的轉基因植物及產品的基因芯片及其應 用，屬于生物芯片

技術介紹
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲得批準種植 和生產，有的被加工成食品、飼料或用做食物添加劑。由于轉基因產品的生態安全和食用安 全一直備受爭議，40多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度。各國轉基因標識制度的相繼建立，對轉基因檢測技術的靈敏度和準確性提出了嚴 格的要求，各種轉基因檢測技術也成為研究熱點。常用的轉基因檢測方法有聚合酶鏈式反 應(PCR)法，外源蛋白檢測法，基因芯片檢測技術。雖然國外對轉基因作物檢測方法研究已 有十幾年，但由于轉基因作物的種類多、數量大，一些轉基因產品經過深加工、各種條件處 理與保存后，轉基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要根據科學技術的發 展不斷更新檢測方法。但不容樂觀的是，設計PCR反應引物是一個棘手的問題，必須確保反應中兩條引 物有相近的熔接溫度，引物之間不會發生相互作用，另外還要注意非特異性擴增，特別是當 非特異性擴增帶與目的帶相近時，就會出現假陽性問題，從而干擾結果的判斷。隨著GMO檢 測技術的發展情況及研究趨勢，基因芯片技術在此展示了更大的優勢。基因芯片檢測原理 是利用帶有熒光標記的樣品同探針特異雜交，從而產生陽性信號。因而非目的帶的擴增只 要不產生陽性信號，就不會干擾，而且芯片檢測不依據電泳條帶。并且基因芯片可根據任 何已知基因組序列設計特異性探針，以人工合成的方法快速制備芯片，且高度并行性、高通 量、微型化、自動化、高準確度和靈敏度等優點具有廣泛的應用前景。經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現關于CryIAc基因的基因芯片檢測技 術的專利報道。
技術實現思路
針對上述現有技術的不足和實際檢測的需要，本專利技術提供了一種檢測含有基因 CryIAc的轉基因植物及產品的基因芯片及其應用。本專利技術是通過以下技術方案實現的一種檢測含有基因CryIAc的轉基因植物及產品的基因芯片，包括表面醛基化 修飾的載玻片和陣列涂布于其上的探針以及核酸固定的陽性對照(HEX)、雜交陽性對照 (PC)、陽性質控探針(18S rRNA)、陰性質控探針、空白對照；其中，所述陽性對照和雜交陽性對照均為北京博奧生物技術有限公司的產品， 晶芯 核酸固定陽性對照(HEX)產品號為502000，晶芯 雜交陽性對照(PC)產品號為 503000。所述陽性質控探針為18S rRNA，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(ClT) 15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG ；所述陰性質控探針為SHDC-人類表達特異蛋白基因，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(ClT) 15-ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC ；所述陽性質控探針和陰性質控探針序列均來源于許小丹，文思遠等(檢測及鑒定轉基因大豆寡核苷酸芯片的制備.農業生物技術學報，2005，13 (4) 429-434)的報道；所述空白對照為點樣液為雙蒸水；所述的基因特CryIAc的探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TCAGAGAGTGGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCG。所述芯片的陣列布局為人為規定，可以任意布局，比如圖1所示的布局。所述載玻片上還可以涂布有探針對照，探針對照包括轉基因玉米Btl76轉化體特 異性探針、轉基因玉米Btll轉化體特異性探針、轉基因玉米TC1507轉化體特異性探針、轉 基因玉米MonSlO轉化體特異性探針和轉基因玉米GA21轉化體特異性探針。所述轉基因玉米Btl76轉化體特異性探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGCCCGTCACCGAGATCTGATGTTCTCTCCTCCATTGATG。所述轉基因玉米Btll轉化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGATTTTTGGTGGAG。所述轉基因玉米TC1507轉化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15- GCGGAACACAAGAACGAAAGCACCTTTTCATTCTTTCATA。所述轉基因玉米MonSlO轉化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ACCTGAACGAGGACTTTCGGTAGCCTTCTTTCATTTCCGA。所述轉基因玉米GA21轉化體特異性探針的序列為NH2-(CH2) 6-0-Poly (dT)15-ATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGTCCG。上述的GA21、BtlU Btl76、TC1507、和Mon810的特異性探針對照均來源于路興 波，武海斌等(轉基因玉米轉化體特異性寡核苷酸芯片檢測方法的研制.作物學報，2009， 35(8) 1432-1438)的報道。所述陽性對照、雜交陽性對照、陽性質控探針、陰性質控探針、空白對照、探針對照 的點樣濃度均為25ymol/L。所述基因CryIAc的探針的點樣濃度為25 μ mol/L。本專利技術的基因芯片的的應用方法為提取待測植物或待測產品的基因組DNA，然 后在二重熒光PCR反應體系中擴增，然后取PCR產物，與雜交液混勻后，于PCR儀中95°C熱 變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區，蓋玻片封片；42°C水浴雜交2h ；雜交后，芯 片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩干，用晶芯 LuxScanTMIOK激光共聚焦掃描儀進行掃描，波長532nm ；PMT為850 V, Power為90 V，產生分析精度 為10 μ m的16位TIFF圖像；用LuxScan3. 0軟件進行數據采集和圖像分析，分析掃描圖像 的熒光強度值以確定待測植物是否含有CryIAc基因；所述雜交液包括3XSSC，0.2% SDS，25% 甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/L PC 雜 交陽性對照樣品；所述洗液I 包括2XSSC，0. IXSDS ；所述洗液II 為 0. 2XSSC。所述熒光染料為Cy3_Amidite。本專利技術的芯片的制備原理是以含有CryIAc基因的轉基因棉花Monl5985為陽 性對照材料，以轉基因玉米GA21、T25、TC1507和Mon88017 ；轉基因大豆GTS40-3-2和 Mon89788 ；轉基因棉花Mon531、轉基因水稻科豐6號、非轉基因玉米鄭單958、非轉基因 大豆1138-2、非轉基因棉花中49等作為對照，根據CryIAc序列，利用Primer premier 5.0引物設計軟件設計特異性引物，并對引物進行篩選和優化。熒光標記引物在5’端用 Cy3-Amidite進行熒光標記。利用 Primer premier 5. (^POligo 6. 0 軟件設計40mer Oligo CryIAc備選探針，探針在5，端以氨基己烷修飾，氨基和探針序列之間以間隔臂poly(dT15) 相連，使最終探本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測含有基因ＣｒｙＩＡｃ的轉基因植物及產品的基因芯片，其特征在于：包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的探針以及核酸固定的陽性對照、雜交陽性對照、陽性質控探針、陰性質控探針、空白對照；其中，所述陽性質控探針為１８ＳｒＲＮＡ，其探針序列為：ＮＨ↓［２］－（ＣＨ↓［２］）↓［６］－Ｏ－Ｐｏｌｙ（ｄＴ）１５－ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＧ；所述陰性質控探針為ＳＨＤＣ－人類表達特異蛋白基因，其探針序列為：ＮＨ↓［２］－（ＣＨ↓［２］）↓［６］－Ｏ－Ｐｏｌｙ（ｄＴ）１５－ＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣ；所述空白對照為點樣液為雙蒸水；所述的基因ＣｒｙＩＡｃ的探針序列為：ＮＨ↓［２］－（ＣＨ↓［２］）↓［６］－Ｏ－Ｐｏｌｙ（ｄＴ）１５－ＴＣＡＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＧ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：路興波，武海斌，孫紅煒，李凡，
申請(專利權)人：山東省農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：88[中國|濟南]