一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法和芯片及其應用技術

本發明專利技術涉及生物醫藥技術領域，特別是涉及一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法和芯片及其應用。本申請公開了一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法，包括以下步驟：使用微濾膜捕獲、富集循環腫瘤細胞；以EpCAM和Vimentin雙適配體作為識別循環腫瘤細胞的標志物，將EpCAM和Vimentin雙適配體連接到兩種不同發射波長的CdTe量子點上，識別微濾膜上富集到的異質型循環腫瘤細胞；對識別后的異質型循環腫瘤細胞進行區分檢測。本申請通過微濾膜富集循環腫瘤細胞，選擇EpCAM和Vimentin雙適配體共同作為識別循環腫瘤細胞的標志物，對識別后的異質型循環腫瘤細胞(EpCAM

【技術實現步驟摘要】
一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法和芯片及其應用


[0001]本專利技術涉及生物醫藥
，特別是涉及一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法和芯片及其應用。

技術介紹

[0002]肺癌是癌癥的主要殺手之一，每年有200萬新病例和180萬死亡病例。其中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占總肺癌病例的85％。NSCLC可進一步細分為兩個主要亞型：肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)。腫瘤復發和轉移是導致患者死亡的重要原因，研究揭示，循環腫瘤細胞在腫瘤的復發和轉移過程中扮演了重要角色；外周血中循環腫瘤細胞的出現，通常預示著腫瘤的存在并可能已經發生轉移
[0003]雖然目前組織活檢是癌癥診斷的金標準，但其侵入性較強，特別是在NSCLC患者中，由于腫瘤部位難以接近或患者不接受，導致組織活檢無法進行。傳統檢測方法如磁共振成像、正電子發射層析掃描、計算機斷層掃描、超聲等檢測范圍局限，難以及時檢測出新生轉移灶。基于循環腫瘤細胞的液體活檢技術已在近些年得到了廣泛的關注，與傳統的侵入性活檢相比，這種診斷方式更加靈活簡便，易于患者接受，能夠在治療過程中或治療后進行重復檢測，具有個體化診斷與治療的優勢，為臨床上進行腫瘤的早期診斷和治療過程及治療后患者狀態的監測提供了重要的工具。
[0004]目前，循環腫瘤細胞的研究主要存在兩大挑戰：循環腫瘤細胞的稀有性和表型異質性。高效靈敏的富集與檢測技術是開展循環腫瘤細胞研究的基礎。循環腫瘤細胞的富集方法可分為基于抗體或適配體與細胞表面標志物結合的免疫親合法和基于細胞本身生物物理特性的物理分離法。免疫親和法中最常見用于捕獲循環腫瘤細胞的標志物是上皮細胞粘附分子(EpCAM)和細胞角蛋白。然而，循環腫瘤細胞在上皮
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間充質轉化過程中，逐漸失去上皮特征，EpCAM的表達降低甚至消失，這就導致循環腫瘤細胞的捕獲效率降低。在物理分離法中，基于循環腫瘤細胞和白細胞尺寸大小的捕獲是最常用的技術。與免疫親和法相比，基于細胞尺寸的分離技術與抗原表達無關，它能夠捕獲表達不同標志物或表達水平不同的異質性循環腫瘤細胞群體。如果能夠將物理分離和免疫親和富集策略相結合，能夠從不同方面實現對循環腫瘤細胞的捕獲，有利于捕獲效率和純度的提高。
[0005]為此，我們提供了一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法和芯片及其應用。

技術實現思路

[0006]為了克服現有技術的不足，本專利技術提供一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法和芯片及其應用，通過聚碳酸酯微濾膜用于富集循環腫瘤細胞，選擇EpCAM和Vimentin雙適配體共同作為識別循環腫瘤細胞的標志物，對識別后的異質型循環腫瘤細胞(EpCAM
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陽性和Vimentin
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陽性)進行區分檢測將檢測到的熒光信號轉導為RGB值，從而實現
細胞個數的精確定量。
[0007]本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0008]本專利技術的第一目的是，提供一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法，包括以下步驟：
[0009]使用微濾膜捕獲、富集循環腫瘤細胞；
[0010]以EpCAM和Vimentin雙適配體作為識別循環腫瘤細胞的標志物，將EpCAM和Vimentin雙適配體連接到兩種不同發射波長的CdTe量子點上，識別微濾膜上富集到的異質型循環腫瘤細胞；
[0011]對識別后的異質型循環腫瘤細胞進行區分檢測。
[0012]優選的，所述微濾膜選用孔徑為8μm的微濾膜。
[0013]優選的，所述微濾膜的過濾速度為5
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10ml/h。
[0014]優選的，使用發射波長520nm的CdTe量子點連接到所述EpCAM適配體的互補鏈；使用發射用波長645nm的CdTe量子點連接到所述Vimentin適配體的互補鏈。
[0015]優選的，所述一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法，包括以下步驟：
[0016]1)MPA
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CdTe量子點的制備
[0017]將CdCl2溶液、MPA和去離子水混合后攪拌，將溶液pH值調至弱堿性后，繼續加入Na2TeO3和NaBH4，進行回流加熱，制備出兩種具有不同發射波長的CdTe量子點；
[0018](2)兩種適配體標記CdTe量子點的制備
[0019]①
Vimentin適配體標記綠色熒光CdTe量子點的制備
[0020]向活化后的熒光CdTe溶液中加入Vimentin適配體溶液，混合均勻后孵育，離心收集后分散至溶液中；
[0021]②
EpCAM適配體標記紅色熒光CdTe量子點的制備
[0022]向活化后的另一熒光顏色CdTe溶液中加入EpCAM適配體溶液，混合均勻后孵育，離心收集后分散至溶液中；
[0023](3)在捕獲區域，加入待測細胞或者血液；使用微濾膜捕獲、富集循環腫瘤細胞；
[0024](4)將兩種適配體標記CdTe量子點混合后注射至微濾膜上，待與微濾膜上的細胞識別完成后，剩余的標記CdTe量子點繼續流入兩個檢測區域；在兩個檢測區域注入鏈霉親和素，然后在每個檢測區域內修飾上Vimentin適配體互補鏈標記紅色熒光CdTe量子點、EpCAM適配體互補鏈標記綠色熒光CdTe量子點，進行孵育；
[0025](5)將孵育后的循環腫瘤細胞的熒光信號轉化為RGB值。
[0026]更優選的，在步驟(4)中，孵育時間為30min。
[0027]本專利技術的第二目的是，提供一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞的芯片，所述芯片為集成了上述所述微濾膜和適配體標記CdTe量子點的芯片。
[0028]優選的，所述芯片包括一個放置有聚碳酸酯微濾膜的捕獲區域，兩個放置有纖維素膜的檢測區域，以及連接捕獲區域和檢測區域的液體通路。
[0029]更優選的，所述捕獲區域的注射速率為5
?
10ml/h。
[0030]本申請的第三目的是，提供一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞的芯片的應用，將上述芯片作為早期診斷設備在富集和區分檢測非小細胞肺癌中循環腫瘤細胞中的應用。
[0031]本專利技術的有益效果是：
[0032]1.本申請設計了的芯片，富集效率高，僅需6min就可實現88.67％的高富集效率和80％的高純度。
[0033]2.本申請的檢測方法，檢測速度快，僅需要30min，且靈敏度高，最低可捕獲2個細胞，特異性強，僅對EpCAM
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陽性和Vimentin
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陽性循環腫瘤細胞產生響應。
[0034]3.本申請的檢測方法，無需對采集到的血液進行任何前處理，直接在芯片內進行全血分析，進一步提高了分析效率。
[0035]4.本申請通過大量臨床樣本實驗，驗證了該芯片應用于臨床的可行性，為臨床富集和檢測異質型循環腫瘤細胞提供了一種可靠的方法，也為臨床早期診斷、病理分期及預后評估本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種用于富集和區分檢測異質型循環腫瘤細胞方法，其特征在于，包括以下步驟：使用微濾膜捕獲、富集循環腫瘤細胞；以EpCAM和Vimentin雙適配體作為識別循環腫瘤細胞的標志物，將EpCAM和Vimentin雙適配體連接到兩種不同發射波長的CdTe量子點上，識別微濾膜上富集到的異質型循環腫瘤細胞；對識別后的異質型循環腫瘤細胞進行區分檢測。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述微濾膜選用孔徑為8μm的微濾膜。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述微濾膜的過濾速度為5
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10ml/h。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，使用發射波長520nm的綠色CdTe量子點連接到所述EpCAM適配體的互補鏈；使用發射用波長645nm的紅色CdTe量子點連接到所述Vimentin適配體的互補鏈。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)MPA
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CdTe量子點的制備將CdCl2溶液、MPA和去離子水混合后攪拌，將溶液pH值調至弱堿性后，繼續加入Na2TeO3和NaBH4，進行回流加熱，制備出兩種具有不同發射波長的CdTe量子點；(2)兩種適配體標記CdTe量子點的制備
①
Vimentin適配體標記綠色熒光CdTe量子點的制備向活化后的熒光CdTe溶液中加入Vimentin適配體溶液，混合均勻后孵育，離心收集后分散至溶液中；
②
EpCAM適配體標記紅色熒...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周信光，何佳駿，
申請(專利權)人：深圳億芯醫療科技有限公司，
類型：發明
國別省市：