一種定量檢測微量末梢血樣本中制造技術

本發明專利技術公開了一種定量檢測微量末梢血樣本中

【技術實現步驟摘要】
一種定量檢測微量末梢血樣本中25
?
羥基維生素D的方法


[0001]本專利技術涉及
25
?
羥基維生素
D
檢測
，更具體地說，涉及一種定量檢測微量末梢血樣本中
25
?
羥基維生素
D
的方法
。

技術介紹

[0002]維生素
D
是一種脂溶性維生素，主要包括維生素
D2
和維生素
D3,
維生素
D
在調劑人體血清鈣
、
磷水平中具有重要生理學作用
。
維生素
D2
主要由植物中的麥角固醇經陽光照射而合成的
。
維生素
D3
可由人體皮膚細胞中的7?
脫氫膽固醇經紫外線照射后進行光化學反應轉變得到，也可通過食物攝取
。
維生素
D
在肝臟經
25
羥化酶催化變成
25
?
羥基維生素
D
，經腎臟的1羥化酶催化，最終生成
1,25
?
二羥基維生素
D
，這是體內維生素
D
主要的生物活性代謝物
。1,25
?
二羥基維生素
D
可以調節小腸等對鈣的吸收
。
由于
1,25
?
二羥基維生素
D
體內含量低
、
半衰期短，該代謝物濃度檢測只適用于一定的疾病狀態
。25
?
羥基維生素
D
含量高
、
半衰期長
、
穩定性好，美國內分泌學會臨床實踐指南推薦檢測
25
?
羥基維生素
D
水平以評估人體內維生素
D
水平
。
[0003]傳統的
25
?
羥基維生素
D
檢測方法有放射免疫法
、
競爭蛋白結合法
、
化學發光免疫測定法等
。
但是主要存在如下問題：有的方法有放射性污染風險；有的方法前處理復雜
、
耗時長；有的方法特異性不足；不能同時準確定量
25
?
羥基維生素
D2
和
25
?
羥基維生素
D3
的含量
。
采用液相色譜
?
串聯質譜法，在多反應監測掃描模式下，可同時檢測
25
?
羥基維生素
D2
和
25
?
羥基維生素
D3
，具有非常高的靈敏度
、
特異性和準確性
。
[0004]采用液相色譜
?
串聯質譜法檢測內源性生物標志物，最根本的挑戰來源于其內源性的特點
。
一般的基于液相色譜
?
串聯質譜的生物分析方法需采用不含分析物的空白基質用于配制校正標樣和質量控制樣本，生物基質中原本存在的內源性分析物可能使分析方法更加復雜，從而導致準確度和精密度下降
。
如何克服內源性分析物的干擾和波動是準確檢測內源性生物標志物的最重要因素之一
。
現階段維生素
D
檢測主要檢測血清樣本中的
25
?
羥基維生素
D2
和
25
?
羥基維生素
D3。
一般采用一定濃度的牛血清白蛋白
(BSA)
作為替代基質進行血清中
25
?
羥基維生素
D2
和
25
?
羥基維生素
D3
的檢測
。
現階段
25
?
羥基維生素
D
的參考范圍也是基于血清樣本的檢測值建立
。
但是對于低齡兒童人群，由于采集靜脈血比較困難，臨床上往往采用采集指尖末梢血作為替代方案
。
采用指尖末梢血進行
25
?
羥基維生素
D
的檢測存在以下幾個困難，一是采血量較少，一般一次在
100
微升左右；二是全血中血清的含量存在個體差異，即受紅細胞壓積
(HCT)
的影響；三是全血中的基質更加復雜，采用
BSA
作為替代基質很難準確定量
。
因此，準確的檢測微量末梢血中的
25
?
羥基維生素
D
存在巨大的挑戰
。
[0005]現有的測定末梢血中
25
?
羥基維生素
D
的方法，
CN113075305A
公開了一種定量檢測末梢血樣本中脂溶維生素含量的方法，所述的脂溶性維生素包括維生素
A
，維生素
D2/D3
，維生素
E。
根據公開的質譜離子對信息，該專利技術所述維生素
D2/D3
實際為
25
?
羥基維生素
D2/D3。
根據實施例1中描述，采用
PBS
作為替代基質用來稀釋配制標準曲線
。PBS
與末梢血
(
或全血
)
樣本差別顯著，在定量檢測上存在顯著的基質差異
。
另外的，
CN110208435B
公開了一種同時
檢測人末梢血中
25
?
羥基維生素
D3
和
25
?
羥基維生素
D2
含量的方法
。
根據該專利技術權利要求
3、
權利要求4及實施例9所述，該專利技術實際上檢測的是末梢血經過離心得到的上清液
(
血清或血漿
)
，而非直接檢測末梢血樣本
。

技術實現思路

[0006]本專利技術的目的在于提供一種定量檢測微量末梢血樣本中
25
?
羥基維生素
D(25(OH)VD)
的方法，解決了無法獲得空白末梢血基質的難題，同時也解決了采用牛血清白蛋白
(BSA)
替代基質與實際樣品存在顯著基質效應差異的問題
。
[0007]本專利技術技術方案提供一種定量檢測微量末梢血樣本中
25
?
羥基維生素
D(25(OH)VD)
的方法，所測的
25
?
羥基維生素
D
為
25
?
羥基維生素<本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.
一種定量檢測微量末梢血樣本中
25
?
羥基維生素
D
的方法，其特征在于，所測的
25
?
羥基維生素
D
為
25
?
羥基維生素
D2
和
25
?
羥基維生素
D3
，
25
?
羥基維生素
D3
的替代分析物為
25
?
羥基維生素
D3
?
d3
，
25
?
羥基維生素
D2
的替代分析物為
25
?
羥基維生素
D2
?
d6
，內標為
25
?
羥基維生素
D3
的同位素內標
,
具體形式為
25
?
羥基維生素
D3
?
d6
，該檢測方法包括如下步驟：
S1
，配制標曲工作液和質控工作液：用
1.0mg/mL 2,6
?
二
?
叔丁基對甲酚的甲醇溶液溶解準確稱量的
25
?
羥基維生素
D2
?
d6
，
25
?
羥基維生素
D3
?
d3
得到對應的標準品儲備液，并稀釋得到不同濃度的標曲工作液和質控工作液；
S2
，配制內標工作液：用
1.0mg/mL 2,6
?
二
?
叔丁基對甲酚的甲醇溶液溶解準確稱量的
25
?
羥基維生素
D3
?
d6
得到
1.0mg/mL
的同位素內標儲備液，然后用
1.0mg/mL 2,6
?
二
?
叔丁基對甲酚的甲醇溶液將上述同位素內標儲備液稀釋成
25ng/mL
的內標工作液；
S3
，樣品處理：取5μ
L
標曲工作液及質控工作液到
2mL96
孔板，加入
95
μ
L
全血基質；取
95
μ
L
末梢血樣本到
2mL96
孔板，加入5μ
L
甲醇；以上樣本混勻加入
100
μ
L
內標工作液，渦旋后離心，再加入萃取劑進行萃取，渦旋后離心取上清液，氮氣吹干后用復溶劑復溶離心后取上清液備用；
S4
，采用液相色譜
?
串聯質譜對待檢測上清液進行檢測和分析
。2.
根據權利要求1所述的一種定量檢測微量末梢血樣本中
25
?
羥基維生素
D
的方法，其特征在于，
S3
中所述萃取劑為正己烷，所述復溶劑為甲醇
、
乙腈和水，且甲醇
:
乙腈
:
水為
4:4:2。3.
根據權利要求1所述的一種定量檢測微量末梢血樣本中
25
?
羥基維生素
D
的方法，其特征在于，
S3
中樣品處理過程為：
A1
：取5μ
L
標準曲線及質控樣本到
2mL96
孔板，加入
95
μ
L
全血基質；取
95
μ
L
末梢血樣本到
2mL96
孔板，加入5μ

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳謙，劉影，祖琴琴，安素芳，蔣艷鑫，劉菲，張倩，王旭，
申請(專利權)人：合肥譜佳醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：