一種制造技術

本發明專利技術屬于醫療技術領域，公開了

【技術實現步驟摘要】
一種MicroRNA133b的檢測方法


[0001]本專利技術屬于醫療
，尤其涉及一種
MicroRNA133b
的檢測方法
。

技術介紹

[0002]腦卒中對中國人群健康的危害性日益突出，我國人口健康領域正面臨著卒中帶來的嚴重挑戰，解決卒中的防治問題是實現改善我國人口健康水平戰略目標的國家重大需求
。
靜脈內注射組織型纖溶酶原激活物
(tPA)
進行藥物溶栓治療是急性缺血性卒中的一線治療，但是治療時間窗局限，血管再通率較低，受益患者人群較少
。
[0003]MicroRNAs
是一類內源性非編碼單鏈小分子
RNA
，長約
20
?
24
個核苷酸，通過與靶基因
mRNA
分子的非翻譯區互補配對，降解
mRNA
或抑制
mRNA
翻譯，從而參與靶基因轉錄后的表達調控
。
一個
microRNA
通常可調節多個靶基因功能，一個基因也可能受多個
microRNA
調節
。MicroRNA
和蛋白質編碼基因之間的相互作用組成復雜的調節網絡
。MicroRNAs
與神經細胞分化
、
軸突形成和突觸可塑性有關
。
[0004]研究發現，
microRNAs
參與缺血性卒中和腦缺血再灌注損傷的發生和發展
。
已有報道對大腦中動脈閉塞
(MCAO)
誘導的急性腦缺血小鼠模型進行
microRNAs
表達譜分析
。
例如，在急性缺血性卒中小鼠模型中，給予外源性
microRNA
?9能顯著改善神經功能評分，減少腦梗塞體積和腦水腫
。
腦梗塞周圍區
microRNA
?
424
在缺血再灌注1小時和4小時明顯上調，
24
小時明顯下調，缺血前腦室給予
microRNA
?
424
激動劑對腦缺血再灌注損傷起神經保護作用
。
但是，
MicroRNA133b
與腦卒中的關系與作為神經保護的潛在治療靶點，尚未見明確報道
[0005]MicroRNA133b
位于
14q32
染色體位點，已有專利報道提示
14q32
位點的幾個
microRNAs
在心腦血管發育和重構方面起著一定作用
。
例如在動物模型上靜脈注射應用
microRNA
?
329、microRNA
?
487b、microRNA
?
494
或者
microRNA
?
495
抑制劑能恢復缺血肢體的血流，減少動脈粥樣硬化斑塊形成，促進血管生成
。
但是，沒有報道干預
MicroRNA133b
與上述情況的關系
。
[0006]通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：
[0007](1)
當前的反轉錄方法可能對不同的
MicroRNA
有不同的反應效率，導致測定結果的偏差
。
[0008](2)
當前用于提取
MicroRNA
的試劑和方法可能無法完全提取出所有的
MicroRNA
，或者在提取過程中可能會帶入其他
RNA
和蛋白質等雜質，影響最后的測定結果
。

技術實現思路

[0009]針對現有技術存在的問題，本專利技術提供了一種
MicroRNA133b
的檢測方法
。
[0010]本專利技術是這樣實現的，一種
MicroRNA133b
的檢測方法，其特征在于，包括：
[0011]對樣品進行采集，使用
RIPA
作為細胞溶解劑，對樣品中的細胞進行破裂以釋放出
MicroRNA
；
[0012]利用針對
MicroRNA
的專用提取試劑對樣品中的
MicroRNA
進行提取，將所得到的
MicroRNA
進行純化，并連接
PolyA
尾巴；
[0013]使用含有莖環結構的引物進行退火處理，然后使用
miScript II RTKit
作為反轉錄試劑，利用連有
PolyA
尾巴的
MicroRNA
和退火后的引物進行反轉錄，生成
cDNA
；
[0014]利用熒光定量
PCR
方法，加入擴增目標
MicroRNA133b
的引物，以生成的
cDNA
為模板，檢測目標
MicroRNA133b
的表達
。
[0015]進一步，所述反轉錄試劑利用特殊設計的引物和反轉錄酶對
MicroRNA
進行反轉錄，生成
cDNA
：
[0016]使用專門為
MicroRNA
設計的引物，引物通常包含能和
MicroRNA
的
3'
端形成互補配對的序列，保證引物能夠和所有的
MicroRNA
進行配對；將這些引物和
MicroRNA
一起加入反應液中，通過退火處理，讓引物和
MicroRNA
形成穩定的配對；加入反轉錄酶和脫氧核苷酸三磷酸，以
MicroRNA
和引物為模板進行反轉錄，生成
cDNA。
[0017]進一步，所述
MicroRNA133b
具有如
SEQ ID No:1
和
SEQ ID No:2
所示的堿基序列
。
[0018]本專利技術另一目的在于提供一種由
MicroRNA133b
制備治療急性腦缺血和腦缺血再灌注損傷的藥物組合物，由
NBO
與
NAC
組成
。
[0019]進一步，
NBO
的有效劑量范圍是
95
％
O2～
100
％
O2。
[0020]進一步，
NAC
的有效劑量是
60mg/kg
～
150mg/kg。
[0021]本專利技術另一目的在于提供所述的藥物組合物在制備治療急性腦缺血和腦缺血再灌注損傷藥物中的應用
。
[0022]本專利技術另一目的在于提供所述的藥物組合物在制備降低缺血再灌注對
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.
一種
MicroRNA133b
的檢測方法，其特征在于，包括：步驟一，對樣品進行采集，使用
RIPA
作為細胞溶解劑，對樣品中的細胞進行破裂以釋放出
MicroRNA
；步驟二，利用針對
MicroRNA
的專用提取試劑對樣品中的
MicroRNA
進行提取，將所得到的
MicroRNA
進行純化，并連接
PolyA
尾巴；步驟三，使用含有莖環結構的引物進行退火處理，然后使用
miScript II RT Kit
作為反轉錄試劑，利用連有
PolyA
尾巴的
MicroRNA
和退火后的引物進行反轉錄，生成
cDNA
；步驟四，利用熒光定量
PCR
方法，加入擴增目標
MicroRNA133b
的引物，以生成的
cDNA
為模板，檢測目標
MicroRNA133b
的表達
。2.
一種
MicroRNA133b
的檢測方法，其特征在于，所述反轉錄試劑利用特殊設計的引物和反轉錄酶對
MicroRNA
進行反轉錄，生成
cDNA
：使用專門為
MicroRNA
設計的引物，引物通常包含能和
MicroRNA
的
3'
端形成互補配對的序列，保證引物能夠和所有的
MicroRNA
進行配對；將這些引物和
MicroRNA
一起加入反應液中，通過退火處理，讓引物和
MicroRNA
形成穩定的配對；加入反轉錄酶和脫氧核苷酸三磷酸，以

【專利技術屬性】
技術研發人員：于永鵬，
申請(專利權)人：青島市中醫醫院青島市海慈醫院，
類型：發明
國別省市：