檢測犬華支睪吸蟲感染膠體金免疫層析試紙及制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種檢測犬華支睪吸蟲感染膠體金免疫層析試紙，同時(shí)還提供了其制備方法，用于犬華支睪吸蟲感染的血清檢測，基于華支睪吸蟲

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
檢測犬華支睪吸蟲感染膠體金免疫層析試紙及制備方法


[0001]本專利技術(shù)涉及一種基于華支睪吸蟲特異抗原
GRN
（
Clonorchis sinensis granulin
，簡稱：
CsGRN
）的檢測犬華支睪吸蟲感染膠體金免疫層析試紙，尤其是提供了一種檢測犬華支睪吸蟲感染膠體金免疫層析試紙，同時(shí)還提供了其制備方法，用于犬華支睪吸蟲感染的血清檢測，屬于免疫學(xué)

。

技術(shù)介紹

[0002]華支睪吸蟲病又稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲（
Clonorchis sinensis
）寄生于犬
、
貓和人等多種動(dòng)物的肝膽管內(nèi)引起的一種人獸共患寄生蟲病
。
其成蟲及分泌排泄物的刺激可導(dǎo)致膽管上皮增生
、
局部擴(kuò)張
、
管壁增厚
、
管腔變窄，并誘發(fā)膽管炎癥
、
肝硬化和肝細(xì)胞癌
。
華支睪吸蟲病在東亞和東南亞流行，全世界有
3500
多萬人感染；在中國，約有
1300
萬人被感染，在
27
個(gè)省均有流行
。
感染華支睪吸蟲的患者患肝硬化和肝膽管癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的數(shù)倍，極大的威脅了全球公共衛(wèi)生安全
。
因此建立一種檢測快速
、
適合基層推廣的血清學(xué)檢測方法和定期的流行病學(xué)調(diào)查可有效降低感染華支睪吸蟲的風(fēng)險(xiǎn)，有利于減少該病造成的危害和損失，對(duì)我國華支睪吸蟲病的防控和人與動(dòng)物的健康發(fā)展具有重要的意義
。
[0003]糞便蟲卵檢測法是目前華支睪吸蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是目前應(yīng)用最廣泛的診斷方法
。
該方法具有簡便
、
成本低的優(yōu)勢，但也存在耗時(shí)
、
對(duì)操作人員專業(yè)性與檢測條件要求高
、
低強(qiáng)度感染時(shí)易發(fā)生漏檢或誤檢
、
不適于實(shí)踐中廣泛推廣等劣勢
。
免疫學(xué)診斷方法是病原學(xué)診斷方法的重要補(bǔ)充，該方法具有特異性強(qiáng)
、
敏感性高
、
穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)
。
目前診斷華支睪吸蟲病常用的實(shí)驗(yàn)室檢查方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（
ELISA
），該方法需要專業(yè)的操作人員，特定的儀器設(shè)備，檢測時(shí)間較長等原因，不適用于基層現(xiàn)場操作
。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0004]本專利技術(shù)的目的是提供一種檢測犬華支睪吸蟲感染膠體金免疫層析試紙及其制備方法，可以快速檢測犬華支睪吸蟲感染，有檢測快速
、
操作簡單
、
不需特定儀器等特點(diǎn)，適合臨床中的現(xiàn)場檢測及大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查
。
[0005]本專利技術(shù)所述的是一種華支睪吸蟲特異抗原基因
GRN
和以該基因?yàn)榭乖苽淠z體金免疫層析試紙條檢測華支睪吸蟲感染，用于檢測華支睪吸蟲感染的血清
。
[0006]本專利技術(shù)所述的華支睪吸蟲特異抗原基因
GRN
（
GenBank
：
KY855531.1
），其基因序列如：
SEQ No.1
所示
。
[0007]本專利技術(shù)所述的是一種華支睪吸蟲特異抗原基因
GRN
獲取的方法，包括以下步驟：根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（
PCR
）擴(kuò)增出目的片段
。
[0008]本專利技術(shù)公開了一種基于
CsGRN
檢測犬華支睪吸蟲感染免疫膠體金層析試紙條的制備方法，通過表達(dá)純化
CsGRN
，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，并確定膠體金溶液的最佳
pH
值和最佳金黃色葡萄球菌
A
蛋白（
SPA
）標(biāo)記量等條件，將
PVC
底板
、
硝酸纖維素膜（
NC
膜）
、
金標(biāo)墊
、
樣品墊
、
吸水紙等進(jìn)行組裝，之后確定組裝好的試紙條的檢測線（
CsGRN
）和
質(zhì)控線（兔抗
SPA
抗體）的最佳包被量，以此為基礎(chǔ)研制出了一種診斷和檢測犬華支睪吸蟲感染的免疫膠體金層析試紙條
。
[0009]檢測華支睪吸蟲抗體膠體金試紙條的制備：將金標(biāo)墊提前用重懸液進(jìn)行浸潤后，放置烘箱中烘干，然后將
PVC
底板
、
金標(biāo)墊
、
硝酸纖維素膜和吸水紙組裝在一起
。
將純化的
CsGRN
和
SPA
分別稀釋至
0.5mg/mL
和
0.25mg/mL
，分別標(biāo)記到硝酸纖維素膜的檢測線上和質(zhì)控線上，即得檢測華支睪吸蟲抗體膠體金試紙條
。
[0010]本專利技術(shù)提供一種上述檢測華支睪吸蟲抗體膠體金試紙條的應(yīng)用，即所述檢測華支睪吸蟲抗體膠體金試紙條在檢測血清中華支睪吸蟲抗體中的應(yīng)用
。
[0011]當(dāng)抗
SPA
抗體沒有與
SPA
結(jié)合則質(zhì)控線
C
線無條帶及表明該試紙條失效；當(dāng)抗
SPA
抗體可以和質(zhì)控線
C
線的
SPA
結(jié)合質(zhì)控線有條帶時(shí)，如果血清中有
GRN
抗體則會(huì)和
GRN
蛋白結(jié)合，此時(shí)
T
線顯色結(jié)果判定為陽性；當(dāng)
T
線無條帶則結(jié)果判定為陰性
。
基于此，本專利技術(shù)所制備得到的檢測華支睪吸蟲抗體膠體金試紙條的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：質(zhì)控線無條帶，試紙條失效；質(zhì)控線和檢測線有條帶，陽性；質(zhì)控線有條帶，檢測線無條帶，陰性
。
[0012]基于華支睪吸蟲
GRN
蛋白制備的犬華支睪吸蟲感染膠體金試紙條具有檢測速度快
、
穩(wěn)定性高
、
特異性強(qiáng)
、
敏感性好
、
操作簡便
、
檢測成本低
、
無需任何儀器設(shè)備
、
檢測樣本多樣性
、
不需要專業(yè)人員
、
對(duì)操作人員的身體危害及環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)
。
檢測結(jié)果直觀易判讀，適于臨床現(xiàn)場中快速診斷和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用，好的檢測方法可以在很大程度上降低犬華支睪吸蟲病發(fā)生和傳播的風(fēng)險(xiǎn)
。
附圖說明
[0013]圖1為
GRN
基因
PCR
擴(kuò)增圖（
M
：
DNA
標(biāo)志物（
DL2000
）；1：
GRNPCR
產(chǎn)物）；圖2為
pET
?
28a
?
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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.
一種用于檢測華支睪吸蟲的膠體金免疫層析試紙，其特征在于：包括樣品墊
、 結(jié)合墊
、
硝酸纖維素膜和底板，所述結(jié)合墊上吸附固定有
SPA
金標(biāo)抗體，所述硝酸纖維素膜設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線固定有
GRN
包被抗原
。2.
如權(quán)利要求1所述的用于檢測華支睪吸蟲的膠體金免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟：華支睪吸蟲特異抗原基因
GRN
的
PCR
擴(kuò)增根據(jù)華支睪吸蟲特異抗原基因
GRN
的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物序列如下：
F:CAGCAAATGGGTCGCGGATCCTGTCCGGACAGGAGGCACG
；
R:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCAAGGACGGACAACACTGC
；
pET
?
28a
?
GRN
表達(dá)載...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李建華，段楊鑫婷，李新，張旭，王曉岑，張西臣，宮鵬濤，張楠，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：吉林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：