核酸特異位點修飾的制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及基于納米信標的核酸特異位點修飾的電化學發(fā)光

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
核酸特異位點修飾的ECL檢測方法、ECL納米信標及其制備方法以及試劑盒


[0001]本專利技術(shù)涉及基于納米信標的核酸特異位點修飾的電化學發(fā)光
(ECL)
檢測方法
、ECL
檢測方法中使用的
ECL
納米信標及其制備方法
、
以及
ECL
檢測方法中使用的試劑盒
。

技術(shù)介紹

[0002]核酸，例如
DNA
和
RNA
中存在著大量的化學修飾，這些化學修飾在不改變核酸序列的前提下，作為一種調(diào)控機制動態(tài)地調(diào)節(jié)著基因的表達
。
[0003]DNA
甲基化
(DNA methylation)
是一類發(fā)生在胞嘧啶5號位碳原子上
、
可穩(wěn)定遺傳的表觀修飾，在動
、
植物基因組中廣泛存在
。DNA
甲基化在哺乳動物的生長發(fā)育過程中廣泛參與多種生理過程，包括基因沉默
、
基因印記
(genomic imprinting)、X
染色體失活以及疾病的發(fā)生等
。
[0004]部分腫瘤的發(fā)生伴隨著特定基因的高甲基化事件，而且基因局部的高甲基化事件早于細胞的惡性增生發(fā)生，因此特定基因的甲基化水平的檢測可作為腫瘤早期預(yù)測和診斷的重要依據(jù)之一
。
例如，早期的結(jié)直腸癌
(CRC)
篩查檢測即是基于表觀遺傳的生物標志物進行的，
FDA
已批準通過檢測特定基因啟動子
CpG
甲基化的增加來進行
CRC
的早期篩查和輔助診斷
(
參見非專利文獻
1)。
另外，不同腫瘤類型發(fā)生高甲基化的抑癌基因不同，例如卵巢癌中，抑癌基因
RASSF1A、BRCA1、APC、CDKN2A
等呈高甲基化狀態(tài)，乳腺癌中，抑癌基因
PCDHB15、WBSCR17、IGF1、GYPC
等呈高甲基化狀態(tài)
(
參見非專利文獻
2)。
通過對這些特定抑癌基因甲基化水平進行檢測，不僅可加強特定腫瘤的篩查和診斷，而且也有助于腫瘤針對性治療效果的評估以及預(yù)后觀察
。
[0005]目前
DNA
甲基化檢測的標準方法是亞硫酸氫鹽處理，具體而言，通過用亞硫酸氫鹽
、
例如亞硫酸氫鈉處理
DNA
，可以將
DNA
中的胞嘧啶
(C)
轉(zhuǎn)化為尿嘧啶
(U)
，但是發(fā)生了甲基化的5?
甲基胞嘧啶
(5
?
mC)
則保持不變，由此通過隨后的
PCR
或測序即可將5?
mC
與
C
區(qū)分開，從而實現(xiàn)對甲基化
DNA
的檢測
。
[0006]但是，亞硫酸氫鹽處理需要在嚴格的化學和溫度條件下進行核酸預(yù)處理，且
PCR
或測序檢測操作復雜，需要專業(yè)技術(shù)人員以及專業(yè)設(shè)備，使得該檢測方法效率低
、
耗時長
、
成本高
。
因此，迫切需要發(fā)展簡單
、
快速
、
靈敏的甲基化
DNA
檢測方法
。
[0007]近期，基于特異性抗體對甲基化位點識別的甲基化
DNA
檢測方法引起了關(guān)注
。
這類檢測方法不需要核酸預(yù)處理，且可以通過對特異性抗體標記不同信標，進行電化學
(
例如非專利文獻
3)、
熒光等檢測
。
[0008]近年發(fā)展起來的
ECL
技術(shù)已在生物分析，例如腫瘤蛋白標記物檢測方面得到廣泛應(yīng)用
(
例如非專利文獻
4)。ECL
技術(shù)是利用電化學原理在電極表面進行電化學反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)而引發(fā)特異性發(fā)光的方法
。
由于
ECL
是電致發(fā)光，相對于熒光而言，不需要外加激發(fā)光源且沒有光漂白和光干擾等影響，因此具有設(shè)備簡單
、
成本低廉
、
背景信號低
、
檢測靈敏度高等優(yōu)點
。
[0009]但是，到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有可行的
、
令人滿意的用于核酸特異性位點修飾檢測的
ECL
檢測方法
。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0011]非專利文獻
[0012]非專利文獻1：
Yvette N Lamb et al.
，
Epi proColon2.0 CE
：
A Blood
?
Based Screening Test for Colorectal Cancer
，
Mol Diagn Ther.2017 Apr
；
21(2):225
?
232
[0013]非專利文獻2：洪婷婷，
DNA
表觀遺傳修飾的特異性檢測，武漢大學，
2017
年，博士學位論文
[0014]非專利文獻3：
Eloy Povedano et al.
，
Amperometric Bioplatforms To Detect Regional DNA Methylation with Single
?
Base Sensitivity
，
Anal.Chem
，
2020
，
92
，
5604
?
12
[0015]非專利文獻4：
Xiaoming Zhou et al.
，
Synthesis,labeling and bioanal ytical applications of a tris(2,2`
?
bipyridyl)Ruthenium(II)
?
based electroc hemiluminescence probe
，
Nat Protoc 2014 May
；
9(5)

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0016]本專利技術(shù)所要解決的課題
[0017]本專利技術(shù)的目的在于提供一種對核酸特異位點修飾進行簡單
、
靈敏
、
快速且通用的電化學發(fā)光檢測方法
。
另外，本專利技術(shù)還提供上述檢測方法中所使用的電化學發(fā)光納米信標及其制備方法
、
以及上述檢測方法中所使用的試劑盒
。
[0018]用于解決課題的手段
[0019]本申請的專利技術(shù)者們針對上述課題進行了大量...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.
一種電化學發(fā)光納米信標的制備方法，其包含下述工序：將金屬配合物離子摻雜到無機氧化物納米粒子上，得到金屬摻雜無機氧化物納米粒子；和將二抗結(jié)合到所述金屬摻雜無機氧化物納米粒子上，得到二抗修飾了的金屬摻雜無機氧化物納米粒子，所述二抗識別核酸特異位點修飾的特異性抗體
。2.
根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述無機氧化物納米粒子為二氧化硅納米粒子
、
二氧化鈦納米粒子
、
氧化鋅納米粒子
、
或氧化鐵納米粒子
、
或者包覆有二氧化硅
、
二氧化鈦
、
氧化鋅或氧化鐵的納米粒子
。3.
根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，所述無機氧化物納米粒子為二氧化硅納米粒子
。4.
根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項所述的制備方法，其中，所述二抗是針對所述特異性抗體的通用部分進行識別的蛋白
。5.
根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項所述的制備方法，其中，所述金屬配合物離子為三
(
聯(lián)吡啶
)
釕
(II)
配合物離子
(Ru(bpy)
32+
)。6.
一種電化學發(fā)光納米信標，其是通過權(quán)利要求1～5所述的制備方法制備的
。7.
一種基于納米信標的核酸特異位點修飾的電化學發(fā)光檢測方法，其包含下述工序：工序1：以修飾有捕獲核酸的磁性微粒為反應(yīng)試劑1與待測樣品混合，對樣品中的目標核酸修飾進行識別捕獲；工序2：以核酸特異位點修飾的特異性抗體為反應(yīng)試劑2對目標核酸的特異位點修飾進行捕獲標記；工序3：以權(quán)利要求6所述的電化學發(fā)光納米信標為反應(yīng)試劑3對工序2中得到的磁性微粒
?
捕獲核酸
?
目標核酸
?
特異性抗體復合物進行檢測信號標記；和工序4：將工序3中得到的磁性微粒
?
捕獲核酸
?
目標核酸
?
特異性抗體
?
納米信標復合物置于電極表面，加入共反應(yīng)劑后進行電化學發(fā)光檢測，根據(jù)電化學發(fā)光信號有無和強度對所述目標核酸進行定性與定量分析
。8.
根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其中，所述核酸為
DNA
或
RNA。9.
根據(jù)權(quán)利要求...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃昊，許奇齊，吳小天，鞠熀先，吳潔，
申請(專利權(quán))人：南京大學，
類型：發(fā)明
國別省市：