以兔膝關節軟骨單位為種子細胞，體外構建組織工程軟骨的實驗方法技術

本發明專利技術屬于組織工程化軟骨體外構建的技術領域，具體涉及一種以兔膝關節軟骨單位為種子細胞，體外構建組織工程軟骨的實驗方法。其步驟如下：留取兔膝關節，將關節軟骨反復剪成碎片組織，沖洗，棄上清，放置于無菌錐形瓶備用；采用ｄｉｓｐａｓｅ酶和ＩＩ型膠原酶按１２ｍＬ?ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養液／ｇ軟骨加入上述錐形瓶內，攪拌，消化，形成消化懸液；將消化懸液過濾、離心，加入原代軟骨細胞培養液，制成無菌的軟骨單位懸液，獲得的軟骨單位進行海藻酸鈉凝膠立體培養構建組織工程軟骨。本發明專利技術的有益效果：軟骨單位體外長期培養過程中形態、增殖情況穩定，分泌ＩＩ型膠原等基質成分生理學功能提高，有望促進組織工程法修復軟骨損傷的效果。

【技術實現步驟摘要】
,體外構建組織工程軟骨的實驗方法
本專利技術屬于組織工程化軟骨體外構建的
，具體涉及一種以兔膝關節軟骨 單位為種子細胞，體外構建組織工程軟骨的實驗方法。
技術介紹
在組織工程化軟骨體外構建過程中，理想種子細胞的選擇最為關鍵，也是目前研 究的難點。目前，國內外文獻報道中，最為常用的關節軟骨組織工程的種子細胞為軟骨細 胞。其體外常規酶解消化方法為0. 4% Pronase酶按12mLDMEM_F12培養液/g軟骨37°C 消化90分鐘，更換培養液后，0.025% II型膠原酶過夜消化，獲取膝關節軟骨細胞。但軟骨 細胞體外培養及傳代過程中，黏彈性逐漸降低，脆性增加，軟骨細胞功能退變比較快，體內 修復軟骨缺損過程中形不成符合正常軟骨特性的透明軟骨組織，成為制約組織工程技術發 展的最大障礙之一。軟骨單位(Chondron)作為近年來才逐漸重視的關節軟骨功能結構，由細胞周基 質及包裹在一個或幾個軟骨細胞共同構成，其在軟骨細胞代謝及力學環境維持方面發揮了 重要作用。我們試圖在體外成功酶解消化獲取兔膝關節軟骨單位的基礎上，以其為種子細 胞，建立體外體外構建組織工程化關節軟骨的實驗方法。
技術實現思路
本專利技術目的在于針對現有以軟骨細胞為組織工程化軟骨種子細胞的不足，提出一 種新的關節軟骨組織工程的種子細胞——軟骨單位(Chondron)的體外獲取方法及其體外 組織工程化軟骨的構建技術。具體是一種兔膝關節軟骨單位體外酶解消化、分離方法的基 礎上，以軟骨單位為種子細胞，以海藻酸鈉凝膠為載體，建立體外構建組織工程化關節軟骨 的實驗方法。本專利技術采用如下的技術方案實現一種，體外構 建組織工程軟骨的實驗方法，其特征在于步驟如下(1)、無菌條件下留取兔膝關節，在超凈工作臺內將膝關節打開，刮取膝關節股骨 和脛骨平臺全層軟骨，將關節軟骨反復剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重， 放置于無菌錐形瓶備用；(2)、采用dispase酶和II型膠原酶按12mL DMEM-F12培養液/g軟骨加入上述錐 形瓶內，即每克軟骨加入DMEM-F12培養液12mL，DMEM-F12培養液中含有質量/體積濃度為 0. 3%的dispase酶和質量/體積濃度為0. 2%的II型膠原酶，上述兩種酶均采用無菌DMEM-F12培養液溶解，經過0. 22 μ m —次性過濾器過濾、 除菌，加入培養液的錐形瓶放置于37°C 5% CO2培養箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進行 聯合酶解攪拌消化3h，形成消化懸液；(3)、將上述消化懸液用10(^111細胞篩網過濾于離心管中，1200印111離心51^11，棄 上清，然后IOmL無菌DMEM-F12培養液反復沖洗、離心3次，加入原代軟骨細胞培養液10mL， 原代軟骨細胞培養液包括DMEM-F12培養基9mL及肽牛血清lmL，制成無菌的軟骨單位懸液， 即獲得了種子細胞——軟骨單位；(4)、上述獲得的軟骨單位進行海藻酸鈉凝膠立體培養，體外構建組織工程軟骨， 步驟如下①、將120mg海藻酸鈉粉劑溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振蕩，混勻，0. 45 μ m—次 性過濾器過濾、除菌備用，②、將軟骨單位懸液計數、離心，棄上清，按4X IO6個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合， 用無菌吸管反復吹打均勻，③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl2 溶液，靜置5 10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球，0. 9% NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養，每 孔接種4粒凝膠球，加入原代培養基3mL，原代培養基包括DMEM-F12培養基2. 7mL及肽牛血 清 0. 3mL。④、將培養板放置于37°C 5% CO2培養箱進行培養，2 3日更換1次培養液，使關 節軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩定生長。 本專利技術利用軟骨單位作為組織工程化軟骨種子細胞，相對現有技術具有如下有益 效果(1)、利用dispase酶和II型膠原酶聯合酶解攪拌消化3小時可以成功獲取兔膝 關節軟骨單位，獲取方法簡單，重復性好。(2)、酶解消化獲得的軟骨單位包括完整的細胞周基質及包裹在內的一個或幾個 軟骨細胞，使得軟骨細胞在體外培養及構建組織工程化軟骨過程中更加符合軟骨細胞在體 內的生長環境及生物學特性。(3)、通過微管吸吮生物力學實驗發現，急性消化軟骨單位平衡 模量(1.573 士 0. 151kPa)、瞬時模量(6. 850 士 0. 607kPa)以及黏彈性指數 (13.423±1.027kPa*S)明顯高于單純軟骨細胞平衡模量(0. 370士0. 013kPa)、瞬時模量 (0. 672士0. 015kPa)以及黏彈性指數(6. 293士0. 134kPa-s)。說明關節軟骨單位較單純細 胞相比生物力學特性明顯提高，改善了軟骨細胞作為種子細胞生物力學特性較差的缺點。(4)、與軟骨細胞相比，軟骨單位體外長期培養過程中形態、增殖情況穩定，分泌II 型膠原等基質成分生理學功能提高，有望促進組織工程法修復軟骨損傷的效果。具體實施例方式本專利技術具體步驟如下(1)、無菌條件下留取兔膝關節。在超凈工作臺內將膝關節打開，銳刀刮取膝關節 股骨和脛骨平臺全層軟骨。用小剪刀將關節軟骨反復剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗， 棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用。(2)、采用0.3% dispase酶(一種中性裂解酶，美國Sigma公司)和0.2% II型 膠原酶(美國Sigma公司)按12mL DMEM-F12培養液/g軟骨加入上述錐形瓶內。兩種酶 均采用無菌DMEM-F12培養液(美國HyClone公司)溶解，經過0. 22 μ m —次性過濾器過濾、除菌。將加入培養液錐形瓶放置于37°C 5% CO2培養箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進 行聯合酶解攪拌消化3h (通過我們連續觀察發現，攪拌消化3h時已肉眼看不見剩余軟骨組 織塊)。(3)、將上述消化懸液用IOOym細胞篩網過濾于15mL離心管中，1200rpm離心 5min,棄上清，IOmL無菌DMEM-F12培養液反復沖洗、離心3次。加入原代軟骨細胞培養液 10mL(DMEM-F12培養基9mL及肽牛血清ImL)，制成無菌的軟骨單位懸液。(4)、上述消化獲得的軟骨單位進行海藻酸鈉凝膠立體培養，步驟如下①、將120mg海藻酸鈉(美國Sigma公司)粉劑溶解于IOmLO. 9% NaCl溶液，振 蕩，混勻，0. 45 μ m —次性過濾器過濾、除菌備用。②、將軟骨單位懸液計數、離心，棄上清。按4X IO6個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合， 用無菌吸管反復吹打均勻。③、用微量移液器吸取40 μ L混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl2 溶液，靜置5 10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球。0. 9% NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養， 每孔接種4粒凝膠球，加入原代培養基3mL (DMEM-F 12培養基2. 7mL及肽牛血清0. 3mL)。④、將培養板放置于37°C 5% CO2培養箱進行培養，2 3日更換1次培養液，使關 節軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩定生長。權利要求一種，體外構建組織工程軟骨的實驗方法，其特征在于步驟如下(1)、無菌條件下留取兔膝關節，在超凈工作臺內將膝關節打開，刮取膝本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種以兔膝關節軟骨單位為種子細胞，體外構建組織工程軟骨的實驗方法，其特征在于步驟如下：（１）、無菌條件下留取兔膝關節，在超凈工作臺內將膝關節打開，刮取膝關節股骨和脛骨平臺全層軟骨，將關節軟骨反復剪成碎片組織，無菌Ｄ－Ｈａｎｋｓ液沖洗，棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用；（２）、采用ｄｉｓｐａｓｅ酶和Ⅱ型膠原酶按１２ｍＬＤＭＥＭ－Ｆ１２培養液／ｇ軟骨加入上述錐形瓶內，即每克軟骨加入ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養液１２ｍＬ，ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養液中含有質量／體積濃度為０．３％的ｄｉｓｐａｓｅ酶和質量／體積濃度為０．２％的Ⅱ型膠原酶，上述兩種酶均采用無菌ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養液溶解，經過０．２２μｍ一次性過濾器過濾、除菌，加入培養液的錐形瓶放置于３７℃５％ＣＯ↓［２］培養箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進行聯合酶解攪拌消化３ｈ，形成消化懸液；（３）、將上述消化懸液用１００μｍ細胞篩網過濾于離心管中，１２００ｒｐｍ離心５ｍｉｎ，棄上清，然后１０ｍＬ無菌ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養液反復沖洗、離心３次，加入原代軟骨細胞培養液１０ｍＬ，原代軟骨細胞培養液包括ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養基９ｍＬ及肽牛血清１ｍＬ，制成無菌的軟骨單位懸液，即獲得了種子細胞－－軟骨單位；（４）、上述獲得的軟骨單位進行海藻酸鈉凝膠立體培養，體外構建組織工程軟骨，步驟如下：①、將１２０ｍｇ海藻酸鈉粉劑溶解于１０ｍＬ０．９％ＮａＣｌ溶液，振蕩，混勻，０．４５μｍ一次性過濾器過濾、除菌備用，②、將軟骨單位懸液計數、離心，棄上清，按４×１０↑［６］個單位／ｍＬ海藻酸鈉凝膠混合，用無菌吸管反復吹打均勻，③、用微量移液器吸取４０μＬ混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌１０２ｍＭＣａＣｌ↓［２］溶液，靜置５～１０分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球，０．９％ＮａＣｌ溶液蘸洗，接種于６孔板培養，每孔接種４粒凝膠球，加入原代培養基３ｍＬ，原代培養基包括ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養基２．７ｍＬ及肽牛血清０．３ｍＬ，④、將培養板放置于３７℃５％ＣＯ↓［２］培養箱進行培養，２～３日更換１次培養液，使關節軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩定生長。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：衛小春，段王平，孫振偉，李琦，
申請(專利權)人：山西醫科大學第二醫院，衛小春，
類型：發明
國別省市：14[中國|山西]