一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法及試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法及試劑盒，所述方法包括：將不含重組蛋白基因的空載體質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞；用生產(chǎn)所述重組蛋白的發(fā)酵工藝及第一步純化工藝，獲得工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白；將所述宿主細(xì)胞蛋白用于免疫至少兩種動(dòng)物，以獲得至少兩種的動(dòng)物抗體；將所述宿主細(xì)胞蛋白作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，將兩種所述動(dòng)物抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，組成所述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，用于檢測待測樣本中殘留的宿主細(xì)胞蛋白

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法及試劑盒


[0001]本專利技術(shù)涉及生物制藥領(lǐng)域，特別涉及一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法及試劑盒
。

技術(shù)介紹

[0002]生物制藥是利用生物活體來生產(chǎn)藥物的方法
。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人工制備的生物原料成為當(dāng)前生物制藥原料的主要來源
。
生物制藥技術(shù)作為戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)技術(shù)，發(fā)展迅猛，在制藥工藝中廣泛應(yīng)用
。
現(xiàn)代生物制藥特點(diǎn)是以基因工程為主導(dǎo)，包括細(xì)胞工程
、
發(fā)酵工程
、
酶工程和組織工程等技術(shù)的應(yīng)用
。
[0003]大多數(shù)生物藥物是通過重組
DNA
技術(shù)，使用宿主細(xì)胞來表達(dá)目標(biāo)蛋白藥物
。
由于宿主細(xì)胞本身的蛋白質(zhì)也會(huì)大量表達(dá)，因此重組蛋白藥物會(huì)受到宿主細(xì)胞蛋白
( Host Cell Protein, HCP)
的污染
。
宿主細(xì)胞中含有各種可能給生物制品造成污染的
HPC、DNA
和內(nèi)毒素等，即使經(jīng)過復(fù)雜的純化步驟，最終獲得的生物藥產(chǎn)品中仍有可能殘留低濃度的
HCP。
[0004]基因工程重組生物制品中殘留的
HCP
作為外源蛋白，其潛在的免疫原性有可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體；其潛在的“佐劑效應(yīng)”也可能會(huì)引起機(jī)體對藥物產(chǎn)生抗體，進(jìn)而影響藥物的療效
。
靈敏度高
、
重復(fù)性好的宿主蛋白檢測方法不僅是保證生物制品安全有效的關(guān)鍵
,
也是生產(chǎn)過程控制和工藝優(yōu)化的重要參數(shù)
。
由于
HCP
可能會(huì)引起不可預(yù)測的免疫反應(yīng)，因此相關(guān)法規(guī)要求對
HCP
進(jìn)行鑒定和定量，以保障患者使用安全
。HCP
殘留檢測是生物藥能否成功獲批的重要因素之一
。
[0005]由于伴隨細(xì)胞凋亡
、
死亡
、
裂解等，除了目標(biāo)蛋白外，其他非必需蛋白也可釋放到細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵上清中
。HCP
構(gòu)成了生物制品生產(chǎn)工藝過程與過程相關(guān)雜質(zhì)的主要組成部分
。
生物制品中殘余
HCP
含量通常被認(rèn)為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（
CQA
），因?yàn)?br/>HCP
有可能影響產(chǎn)品的安全性和功效
。HCP
可以起免疫原性的作用而直接激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對特定
HCP
雜質(zhì)的抗體，同時(shí)也可以作為佐劑從而增加機(jī)體對治療蛋白的免疫反應(yīng)以及產(chǎn)生抗抗體，進(jìn)而直接影響藥物的生物分布
、
藥代動(dòng)力學(xué)和生物活性等
。
[0006]目前，商品化的
HCP
試劑盒檢測結(jié)果只代表通用的
HCP
含量和比例，但是每個(gè)項(xiàng)目都有其特異的
HCP
比例，而且各個(gè)蛋白對
HCP
的檢測干擾程度不一樣，所以建立專屬的
HCP
檢測方法是非常必要的
。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0007]本專利技術(shù)的目的在于提供一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法及試劑盒，可以更有目的性地
、
更加準(zhǔn)確地檢測出目的重組蛋白藥品中的宿主細(xì)胞蛋白殘留，提高檢測的靈敏性
。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)的一個(gè)方面提供了一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法，包括：步驟
S101
：提供宿主細(xì)胞，將不含重組蛋白基因的空載體質(zhì)粒導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞；
步驟
S102
：用生產(chǎn)所述重組蛋白的發(fā)酵工藝及第一步純化工藝，獲得工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白；步驟
S103
：將所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白用于免疫至少兩種動(dòng)物，以獲得至少兩種動(dòng)物抗體；步驟
S104
：將所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，選取兩種所述動(dòng)物抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，組成所述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，用于檢測待測樣本中殘留的宿主細(xì)胞蛋白；其中，所述重組蛋白為利拉魯肽前體，所述待測樣本為利拉魯肽前體產(chǎn)品或利拉魯肽產(chǎn)品；所述步驟
S102
包括：步驟
S102
?1：將所述宿主細(xì)胞發(fā)酵及
IPTG
誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲得原液；步驟
S102
?2：將所述原液離心以獲得菌體；步驟
S102
?3：在所述菌體中加入裂解緩沖液獲得菌體重懸液；步驟
S102
?4：將所述菌體重懸液通過高壓均質(zhì)及離心后收集上清液，所述上清液經(jīng)濾膜過濾后獲得含所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白的蛋白液；步驟
S102
?5：將所述蛋白液經(jīng)過鎳柱純化后，獲得所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白；所述步驟
S102
?5包括：所述鎳柱為采用
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)填充的層析柱；依次采用平衡緩沖液
、
所述蛋白液
、
所述平衡緩沖液
、
洗脫緩沖液過柱；所述平衡緩沖液的配方為：
24~25mM
咪唑
、48~51mM
磷酸鹽
、290~310mM
氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
6.8
?
7.2
；洗脫緩沖液的配方為：
390~410mM
咪唑
、48~51mM
磷酸鹽
、290~310mM
氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
8.0
?
8.2。
[0009]優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液的配方為：
400mM
咪唑
、50mM
磷酸鉀
、300mM
氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
8.1。
[0010]優(yōu)選的，取所述層析柱
4~6
倍柱體積的所述平衡緩沖液過柱，控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以平衡所述層析柱；取所述層析柱
6~9
倍柱體積的所述蛋白液過柱，控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以使所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白附著在所述
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)；取所述層析柱
6~8
倍柱體積的所述平衡緩沖液過柱，控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以洗滌所述
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)；取所述層析柱
6~9
倍柱體積的所述洗脫緩沖液過柱；控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以洗脫附著在所述
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)的所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白
。
[001本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.
一種工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法，其特征在于，包括：步驟
S101
：提供宿主細(xì)胞，將不含重組蛋白基因的空載體質(zhì)粒導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞；步驟
S102
：用生產(chǎn)所述重組蛋白的發(fā)酵工藝及第一步純化工藝，獲得工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白；步驟
S103
：將所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白用于免疫至少兩種動(dòng)物，以獲得至少兩種動(dòng)物抗體；步驟
S104
：將所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，選取兩種所述動(dòng)物抗體分別作為捕獲抗體和檢測抗體，組成所述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒，用于檢測待測樣本中殘留的宿主細(xì)胞蛋白；其中，所述重組蛋白為利拉魯肽前體，所述待測樣本為利拉魯肽前體產(chǎn)品或利拉魯肽產(chǎn)品；所述步驟
S102
包括：步驟
S102
?1：將所述宿主細(xì)胞發(fā)酵及
IPTG
誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲得原液；步驟
S102
?2：將所述原液離心以獲得菌體；步驟
S102
?3：在所述菌體中加入裂解緩沖液獲得菌體重懸液；步驟
S102
?4：將所述菌體重懸液通過高壓均質(zhì)及離心后收集上清液，所述上清液經(jīng)濾膜過濾后獲得含所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白的蛋白液；步驟
S102
?5：將所述蛋白液經(jīng)過鎳柱純化后，獲得所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白；步驟
S102
?5包括：所述鎳柱為采用
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)填充的層析柱；依次采用平衡緩沖液
、
所述蛋白液
、
所述平衡緩沖液
、
洗脫緩沖液過柱；所述平衡緩沖液的配方為：
24~25mM
咪唑
、48~51mM
磷酸鹽
、290~310mM
氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
6.8
?
7.2
；洗脫緩沖液的配方為：
390~410mM
咪唑
、48~51mM
磷酸鹽
、290~310mM
氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
8.0
?
8.2。2.
如權(quán)利要求1所述的工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法，其特征在于，所述裂解緩沖液的配方為：
1.8~2.2mM 乙二胺四乙酸
、24~26mM 咪唑
、49~51mM 磷酸鹽和
295~305mM 氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
6.8
?
7.2。3.
如權(quán)利要求1所述的工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法，其特征在于，所述洗脫緩沖液的配方為：
400mM
咪唑
、50mM
磷酸鉀
、300mM
氯化鈉，
pH
調(diào)節(jié)為
8.1。4.
如權(quán)利要求1所述的工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法，其特征在于，取所述層析柱
4~6
倍柱體積的所述平衡緩沖液過柱，控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以平衡所述層析柱；取所述層析柱
6~9
倍柱體積的所述蛋白液過柱，控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以使所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白附著在所述
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)；取所述層析柱
6~8
倍柱體積的所述平衡緩沖液過柱，控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以洗滌所述
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)；取所述層析柱
6~9
倍柱體積的所述洗脫緩沖液過柱；控制過柱的線性流速為
85~90cm/h
，以洗脫附著在所述
Ni
?
NTA
親和層析介質(zhì)的所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白
。
5.
如權(quán)利要求1所述的工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白殘留的檢測方法，其特征在于，在所述步驟
S103
中，將所述工藝特異性宿主細(xì)胞蛋白用于免疫鼠和兔，以獲得鼠抗體和兔抗體，獲得所述鼠抗體和所述兔抗體的步驟包括：對所述鼠進(jìn)行4次免疫，第一次免疫
、
第二次免疫和第三次免疫的間隔時(shí)間為2周，第四次免疫與第三次免疫的間隔時(shí)間為4...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳淑貞，田竣元，吳鴻雪，蔡映蕓，黃娟，吳玉水，
申請(專利權(quán))人：福建基諾厚普生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：