本發明專利技術公開了一種抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞系及其所分泌的單克隆抗體，以原核表達制備重組的Ｐ３０可溶性抗原，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，利用雜交瘤技術經融合、篩選、克隆，獲得能穩定分泌抗非洲豬瘟病毒Ｐ３０蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本發明專利技術也公開了用該細胞系制備單克隆抗體、抗體提純方法及該抗體的辣根過氧化酶標記法。該單克隆抗體可用于豬血清中非洲豬瘟病毒抗體的檢測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術及細胞工程領域，涉及分泌抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體雜交 瘤細胞系及其分泌的單克隆抗體，以及所述單克隆抗體的純化和辣根過氧化物酶標記，可 應用于檢測豬血清中非洲豬瘟病毒抗體。
技術介紹
非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一 種急性、熱性、高度接觸的烈性傳染性疾病。其特征為病程短、病死率高率，可高達100%，臨 床癥狀和病理變化均類似于急性豬瘟，在診斷時極易誤診，表現高熱、皮膚充血發紺、流產、 /K月中及臟器出血。(Wi lliam, Hess Adv. African swine fever a reassessment . Vet Sci Comp Med，1981，25 :39 69)世界動物組織(ΟΙΕ)列為A類疫病，我國規定為動物一類疾 病，受到世界各國的高度重視(孫懷昌.中國預防獸醫學報，1999，21(2) :117 119)。本病自1921年在肯尼亞發現以來，一直存在于撒哈拉以南的非洲國家，1957年先 后流傳至西歐和拉美國家，多數被及時撲滅，單在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁島 仍有流行，截至目前已在非洲、歐洲和美洲等數十個國家流行，而且有不斷蔓延趨勢。2007 年，亞美尼亞連續發生六起非洲豬瘟，我國尚無該病。非洲豬瘟在國際病毒分類委員會第四次報告中歸于虹彩病毒科，在該委員會第五 次報告中將其列在痘病毒科之下，置于該科的脊椎動物痘病毒亞科及昆蟲痘病毒亞科之外。 但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之間的特征，ASFV的這一特性表 明它不屬于國際病毒分類委員會所核定的任何一科，是個新科，1995年第9次國際病毒分類 委員第六次報告，將非洲豬瘟病毒列入“類非洲豬瘟病毒屬”，非洲豬瘟是唯一已知的代表種。非洲豬瘟病毒是一種大的、有囊膜的雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA病毒。其 基因組為末端共價閉合的單分子線狀雙鏈DNA，病毒基因組全長為170kb 190kb，中央 有125kb左右的保守區，兩端為可變區，含有末端反轉重復序列，這些重復序列的增加 或者缺失是造成不同分離株基因組長度差異的主要原因(Rafael，Yancz, Javier Μ, et al. Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus· Virology, 1995，208 249 279)。ASF病毒基因組有5個編碼基因，包括假定膜蛋白、分 泌性蛋白、參與核甘酸和核酸代謝(DNA修復)以及蛋白修飾的酶，整個基因組含有151個 0RF，可以編碼150 200種蛋白質，已從ASFV感染的細胞中分離鑒定出86種病毒蛋白多 肽(曲連東，于康震，非洲豬瘟研究進展，中國獸醫科技，1998,28(11) :42 43)。非洲豬瘟病毒大多數毒株的毒力都很強，但是免疫原性很低，只有少數幾個蛋白 具有免疫原性。實驗證明，P30蛋白為具有較好抗原性的蛋白之一，蛋白分子量約為36KD。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種分泌特異性識別非洲豬瘟病毒的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本專利技術的另一目的是提供上述細胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體，所述單抗對非洲豬瘟結構蛋白P30抗原有較好的特異性。本專利技術的另一目的是提供上述抗體的純 化及辣根過氧化酶標記的酶標記物。為了解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案是一種抗非洲豬瘟病毒單克隆 抗體的雜交瘤細胞系，所述細胞系的保藏號為CGMCCN0. 3771。所述的雜交瘤細胞系是通過雜交瘤技術以原核表達的重組可溶性蛋白P30作為 免疫原建立的。所述雜交瘤細胞系分泌的抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體。所述的單克隆抗體純化后經過碘酸鈉法制備辣根過氧化物的酶標記物。本專利技術的有益效果是該專利技術所制備的雜交瘤細胞株ASFV :P30Mab及其分泌的單 克隆抗體能夠識別ASFV天然抗原，所獲得的單克隆抗體不僅在ASFV基礎研究，而且在ASFV 抗原抗體免疫反應的檢測試劑中均具有很高的實用價值。附圖說明圖1為重組P30蛋白純化后SDS-PAGE圖。圖2為重組P30蛋白純化后western blotting圖。具體實施例方式抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞系保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心CGMCC NO. 3771，保藏日2010-04_22，分類命名雜交瘤細胞株。下面結合具體實施方式對本專利技術作進一步詳細說明本專利技術的技術方案如下一、建立細胞系1.抗原制備a)非洲豬瘟P30蛋白的表達根據GenBank中非洲豬瘟(ASFV)P30基因序列，設計合成了 1對引物，采用PCR方 法從ASFV DNA中擴增出P30基因片段，將其克隆到表達載體pET28b中，構建了重組質粒 PET-P30，測序驗證后轉化入表達宿主菌BL21 (DE3)，經IPTG誘導表達。設計的引物為P30-1-5，-GCGGATCCTAATTTTAAAATTGAATGGAT-3 ‘P30-2-5，-GTCTCGAGCCCAATCAAAATTAGATAACT-3 ‘下劃線部分為引入的酶切位點，P30-1為ASFV P30基因上游擴增引物，引入的酶 切位點為BamHI ；P30-2為ASFV P30基因下游擴增引物，引入的酶切位點為Xhol。b)非洲豬瘟P30蛋白的純化誘導結束后，離心收集誘導后菌體，用PBS洗滌重懸菌體，超聲裂解(超聲ls，間隔 ls，共IOmin)，12000rpm離心，分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。蛋白純化時使用 鎳離子親和層析柱，純化后，經SDS-PAGE、western blotting鑒定，獲取到單一條帶，并具備 較好的抗原性(見附圖1，2)。使用BCA法測定純化后蛋白含量，標準品濃度及其對應的OD 值見表1。純化后P30蛋白的OD值為2. 25，與標準品比較后，其濃度為1700μ g/ml。<table>table see original document page 5</column></row><table>次基礎免疫皮下注射抗原200 μ g，使用完全弗氏佐劑；每隔3周進行一次免疫，共三次， 50μ g/只/次，最后一次基礎免疫后3周后脾內注射加強免疫，25 μ g/只，免疫完成。3.雜交瘤細胞的制備a)飼養細胞的制備以BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞。融合前1天，將小鼠拉頸處死，體表 消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用 注射器注射IOml RPMI 1640培養液至腹腔，反復沖洗，回收沖洗液，1000r/min離心10分 鐘，棄上清。用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸沉淀，調整細胞濃度為2XlO5Ail。 將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0. 1ml，置37°C，6% CO2的培養箱中培養過夜。b)免疫脾細胞的制備取免疫完成后的BALB/c小鼠，通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘， 無菌條件下取出脾臟，至于平皿中，RPMI 1640培養液清洗1次。將脾臟移入另一盛有IOml R本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其特征在于，所述細胞系的保藏號為ＣＧＭＣＣ ＮＯ．３７７１。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：董志珍，侯艷梅，肖妍，趙祥平，王濤，張瑞，楊新梅，
申請(專利權)人：天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，
類型：發明
國別省市：12[中國|天津]
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