一種鹿花盤制造技術

本發明專利技術提供了一種鹿花盤

【技術實現步驟摘要】
一種鹿花盤DNA真偽鑒定方法


[0001]本專利技術涉及接生物中藥材鑒定
，尤其涉及一種鹿花盤
DNA
真偽鑒定方法
。

技術介紹

[0002]鹿花盤是鹿茸鋸掉之后，留在角柄上剩余鹿茸的骨化物，每年脫掉，形狀如盤，故稱“鹿花盤”，也叫“鹿角盤”、“鹿角帽”?！?br/>中華人民共和國藥典
》2020
年版收載：鹿科動物馬鹿
Cervus elaphus Linnaeus
或梅花鹿
Cervus nippon Temminck
已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基為正品
。
鹿角
、
鹿花盤二者實屬一物，不同的是鹿角的骨化程度低于鹿花盤
。
其產地主要為黑龍江
、
吉林
、
遼寧
、
四川
、
青海
、
內蒙古
、
新疆等地
。
[0003]鹿花盤化學成分主要包括水
、
無機物和有機物三大類，富含有大量人體需要的且不能合成的氨基酸，還含有鈣
、
磷
、
鎂
、
鈉
、
鉀
、
鐵
、
錳
、
鋅
、
鍶
、
鋇等元素
。《
本草綱目
》
記載：“鹿角，生用則散熱行血，消腫辟邪；熟用益腎被虛，強精活血”。
鹿花盤味咸
、
微溫
、
無毒，入肝
、
腎經，具有行血
、
活血消腫
、
溫補肝腎
、
強健筋骨等功能
。
對治療發熱
、
腫痛
、
兒童痄腮
、
婦女乳房腫脹
、
乳腺炎
、
乳腺增生，預防子宮肌瘤
、
乳腺癌等有明顯的效果
?！盵0004]鹿花盤作為貴重藥材，近些年來，產源不足但需求量日益增加，使得不同渠道來源的偽品
、
混淆品和代用品在國內的藥源市場屢見不鮮
。
價格低廉且未收入國家標準的馴鹿
、
豚鹿
、
爪哇鹿
、
坡鹿
、
駝鹿
、
麋鹿等的角盤也進入中藥市場，致使鹿花盤商品來源復雜，藥材市場極為混亂
。
偽品鹿花盤的價格依舊昂貴卻不具備藥用效果，不僅延誤病人的救治，而且嚴重影響我國傳統藥學的發展，更制約著中國傳統醫藥的規范化
、
標準化和國際化
。
[0005]常用的鑒定鹿花盤方法有性狀鑒定
、
顯微鑒定及理化鑒定等
。
性狀鑒別主要是指從鹿花盤的外觀形態
、
氣
、
味
、
色澤
、
質地以及斷面的感觀特征進行綜合分析，方法簡單，但要求從業人員經驗豐富，且存在主觀性強
、
重復性差
、
穩定性低等問題
。
而且作為藥材形態通常是不完整的，因此鑒定難度較大
。
顯微鑒定是利用顯微鏡觀察藥材的內部組織構造
、
細胞形態，有學者從顯微結構的角度，分別以表征其骨化程度的顯微特征“骨陷窩長
/
短徑比”和“骨陷窩面積比”為鑒定參數，對鹿花盤真偽鑒別提供了參考，但這一方法不能揭示細胞內在信息，無法精準鑒別近緣物種
。
理化鑒定是利用儀器對其有效成分進行分析，但鹿花盤成分復雜，含有許多有機物和無機物種類，對極易混淆的近緣物種不易區分，難以達到藥材質量控制的目的
。
[0006]上述鑒定鹿花盤的方法均存在一定的局限性，所以急需建立一套準確
、
有效
、
標準的鹿花盤藥材鑒定方法，實現鹿花盤的真偽鑒定，確保藥材質量，保障臨床用藥的安全性與準確性
。
[0007]隨著現代科學分析技術的發展，
DNA
分子遺傳標記技術在中藥材鑒定中經常被使用，這種標記技術具有多態性強
、
操作簡單
、
對樣品要求低，特異性強和靈敏度高等優點
。
利用
DNA
分子標記技術對中藥材鹿花盤進行鑒別，直接從遺傳物質
DNA
的核苷酸序列上檢測遺傳變異
。
[0008]細胞色素
b(cytochrome b
，
Cytb)
位于線粒體內膜脂質雙分子層中，是參與氧化磷
酸化合成
ATP
過程電子傳遞鏈中的重要物質，是線粒體自身編碼的為數不多的功能蛋白，其基因的進化速度適中，近年來被廣泛應用于系統發育
、
種類鑒別等的研究
。
細胞色素
C
氧化酶亞基
1(cytochrome c oxidase subunit1
，
COI)
是線粒體中約
650bp
的一段序列，它的基因進化速度比
Cytb
基因更快，因此可以用來區分進化非常緊密的物種
。
[0009]胡文忠等人公開了一種鹿花盤的鑒定方法：取鹿花盤樣品粉分別用正己烷
、
石油醚等溶劑進行溶劑提取，分別測定其提取物紅外光譜圖，之后將兩紅外光譜圖與已知的正品鹿花盤標準譜圖進行峰位
、
峰強度
、
峰形和波數等的對比分析來鑒定鹿花盤真偽
(
授權號：
102252993)。
但是紅外光譜鑒定樣品制備要求高，通常需要將其研磨成細粉或制備成透明片，以便于光譜測量
。
這個過程可能會引入樣品處理的誤差，導致鑒定結果的不確定性
。
而且許多中藥材化學成分復雜，紅外光譜只能提供它們的整體指紋譜圖，無法對每個成分進行詳細的鑒定，缺乏準確性
。

技術實現思路

[0010]本專利技術的目的在于針對上述現有技術的不足，提供了一種鹿花盤
DNA
真偽鑒定方法
。
[0011]本專利技術提供的技術方案是：一種鹿花盤
DNA
真偽鑒定方法，包括以下步驟：
[0012]S1
：
DNA
提??；
[0013]1)
樣本裂解：將待檢樣品用
70
％酒精清洗
3min
，
37℃
烘箱中揮發酒精，用剪刀剪碎至
1mm3左右，稱取樣品
0.1g
放入離心管中，加入
500
μ
l
裂解液...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.
一種鹿花盤
DNA
真偽鑒定方法，其特征在在于，包括以下步驟：
S1
：
DNA
提?。?br/> 1)
樣本裂解：將待檢樣品用
70
％酒精清洗
3min
，
37℃
烘箱中揮發酒精，用剪刀剪碎至
1mm3左右，稱取樣品
0.1g
放入離心管中，加入
500
μ
l
裂解液
、15
μ
l
蛋白酶
K(20mg/ml)
和
30
μ
l10
％
SDS(
十二烷基磺酸鈉
)
，混勻后置于
56℃
水浴振蕩
16
～
18h
，轉速
100r/min
；
2)
沉淀：直接向裂解后的樣品中加入
500
μ
l
沉淀液
(
主要含有
NaAC)
，充分混勻，
11,000r/min 4℃
離心
10min
，取上清液加入等體積的異丙醇，
?
20℃
放置
1h
，
11,000r/min 4℃
離心
10min
，棄上清，留沉淀；
3)
洗滌：使用洗滌液
(
主要含有
70
％乙醇
)
洗滌沉淀兩到三次，干燥沉淀，溶于滅菌雙蒸水中，
?
80℃
保存，作為檢測
DNA
模板；
S2
：
PCR
引物設計與合成；
1)
通過前期實驗樣品測序分析獲得鹿花盤樣品
COI
序列，利用
BioEdit
軟件進行序列比對分析，同時采用
Primer 3.0(https://primer3.ut.ee/)
在線網站設計正品鹿花盤特異性引物，并用
Oligo 6.0
進行再次引物驗證；
COI:
上游引物
5'
?
ACACCCTAATCAACTGGC...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王衛社，高麗君，李晴，張麗華，王冰梅，王蕊，王云龍，曹亮亮，曲永梅，
申請(專利權)人：吉林國安藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：