雙功能基因組編輯系統及其用途技術方案

本發明專利技術涉及基因工程領域

【技術實現步驟摘要】
雙功能基因組編輯系統及其用途
[0001]本申請是申請號為
202010660449.6
，申請日為
2020
年7月
10
日
、
專利技術名稱為“雙功能基因組編輯系統及其用途”的中國專利技術專利申請的分案申請
。


[0002]本專利技術涉及基因工程領域
。
具體而言，本專利技術涉及包含
CRISPR
核酸酶結構域和脫氨酶結構域的基因組編輯融合蛋白，以及包含所述基因組融合蛋白的雙功能基因組編輯系統及其用途
。
[0003]專利技術背景
[0004]CRISPR/Cas9
基因編輯系統是在向導
RNA
引導下
Cas9
結合并切割目的基因的雙鏈
DNA
形成雙鏈斷裂
(Double
?
stranded break
，
DSB)
，在機體的修復過程中引入不同片段長度的插入和
/
或缺失
。
該系統簡便
、
高效，被廣泛應用于基因功能研究和利用
。
但是它產生的編輯效果具有不確定性，很難實現基因的定點編輯
。
而由
nCas9(D10A)
融合胞嘧啶脫氨酶
(Cytosine deaminase)
形成的單堿基編輯系統在不產生雙鏈斷裂的情況下實現胞嘧啶到胸腺嘧啶的轉換，已在植物
、
動物以及人細胞中進行了高效的基因定點突變
。
這兩種基因編輯系統已經被廣泛用于疾病治療研究
、
動物模型建立
、
植物遺傳育種方面
。
然而，這兩種基因編輯系統工作原理不同，適用范圍不同，編輯產生的結果也不完全相同
。
[0005]在植物的遺傳改良乃至生物醫學研究過程中，往往需要同時編輯多個基因或者一個基因的不同區域，產生特定基因片段的敲除
(indel)
和特定核苷酸的替換
。
根據現有的基因編輯工具，有兩種策略可以實現這一結果
。
一種是共轉化用于敲除和堿基替換的系統
(sgRNA、SpCas9
和
nCas9
?
APOBEC1
或
A3A
?
PBE)
，這種方法需要單次轉化的外源
DNA
量多，對轉化過程是一個考驗，同時大量的外源
DNA
對細胞具有很大毒性
。
另外獲得同時含有堿基替換和
indel
突變的目的植株的效率低，篩選工作量巨大
。
另一種方法是分批轉化，先轉化用于基因敲除的
sgRNA
和
Cas9
，組培篩選獲得含有目的基因
indel
的突變體植株，然后以含有目的基因
indel
的突變體植株為受體材料用單堿基編輯系統進行第二次轉化，這種方法需要經過兩次遺傳轉化操作，轉化工作量大
、
成本高
、
周期長
。
[0006]到目前為止，還沒有一種可以同時實現高效的堿基替換和
indel
的基因編輯系統
。
利用雙功能系統通過單次轉化實驗同時實現包括植物在內的多個物種高效的
C
至
T
替換和特定位置的
indel。
不同長度的向導
RNA
控制靶基因組位點的編輯結果，在編碼區和非編碼區產生多樣化的突變
。
尤其是針對一些難以轉化或轉化周期長的作物品種，可以大大縮短周期，加快育種進程；雙功能系統也可以用于研究基因的啟動子區調控序列與調控元件的作用關系；也可以用于疾病的治療研究，有很多疾病是由于基因序列中的單核苷酸的突變和缺失插入突變共同引起的，雙功能基因編輯可為這類疾病的治療提供了一個快速可用的解決方案
。
總之，開發一種雙功能的基因編輯系統是非常必要的，可以在疾病治療
、
動物模型建立
、
植物遺傳育種方面有廣闊的應用前景
。
[0007]附圖簡述
[0008]圖1：
APOBEC1
?
nCas9
?
UGI、APOBEC3A
?
eSpCas91.1
?
UGI、APOBEC3A
?
nCas9
?
UGI
和
APOBEC3A
?
Cas9
?
UGI
構建體的示意圖
。
[0009]圖2：比較
APOBEC3A
?
eSpCas91.1
?
UGI、APOBEC3A
?
nCas9
?
UGI
和
APOBEC1
?
nCas9
?
UGI
在使用含有不同長度引導序列的
sgRNA
時
C
至
T
堿基替換的頻率
。
數據來源于在水稻原生質體的
OsCDC48
基因靶位點，未處理的原生質體樣品用作對照
。
數據來自三個獨立的生物學重復
(n
＝
3)
，計算每個頻率
(
平均值
±
標準誤差
)
[0010]圖3：比較
APOBEC3A
?
eSpCas91.1
?
UGI
在使用含有不同長度引導序列的
sgRNA
時和
pJIT
?
163
?
Ubi
?
Cas9
在使用含有
20nt
引導序列的
sgRNA
時產生
indel
的效率
。
數據來源于在水稻原生質體的
OsCDC48
基因靶位點，未處理的原生質體樣品用作對照
。
數據來自三個獨立的生物學重復
(n
＝
3)
，計算每個頻率
(
平均值
±
標準誤差
)
[0011]圖4：比較
APOBEC3A
?
eSpCas91.1
?
UGI、APOBEC3A
?
nCas9
?
UGI
和
APOBEC1
?
nCas9
?
UGI
在使用含有不同長度引導序列的
sgRNA<本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.
一種用于植物細胞基因組編輯的雙功能基因組編輯系統，所述系統包括基因組編輯融合蛋白和
/
或包含編碼所述基因組編輯融合蛋白的核苷酸序列的表達構建體，以及
i)
至少一種用于堿基替換的向導
RNA
和
/
或包含編碼所述至少一種用于堿基替換的向導
RNA
的核苷酸序列的表達構建體，和
/
或
ii)
至少一種用于插入和
/
或缺失的向導
RNA
和
/
或包含編碼所述至少一種用于插入和
/
或缺失的向導
RNA
的核苷酸序列的表達構建體，其中所述基因組編輯融合蛋白包含具有核酸酶活性的
CRISPR
效應蛋白結構域和脫氨酶結構域，其中用于堿基替換的向導
RNA

【專利技術屬性】
技術研發人員：高彩霞，張華偉，范榮，柴壯壯，
申請(專利權)人：蘇州齊禾生科生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：