微小制造技術

本發明專利技術涉及可用于定量檢測微小

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】微小RNA的定量檢測


[0001]本專利技術涉及可用于定量檢測微小
RNA
的新型組合物和方法
。
更具體來說，它涉及可以在用于檢測
miR
?
34
的逆轉錄酶
?
定量聚合酶鏈反應
(RT
?
qPCR)
中使用的預混物
。

技術介紹

[0002]微小
RNA(miRNA)
是一個內源性
、
小的
、
非編碼的功能性
RNA
家族，通過與靶
mRNA
的
3'
?
UTR
結合來抑制蛋白質的翻譯
。
它們也被發現是有用的循環生物標志物
。
例如，
hsa
?
miR
?
34a
?
5p
的水平與非酒精性脂肪性肝病
(NAFLD)
和非酒精性脂肪性肝炎
(NASH)
相關
。
因此，需要用于定量檢測
miRNA
的準確手段
。
逆轉錄酶定量聚合酶鏈反應
(RT
?
qPCR)
是最廣泛使用的定量檢測
miRNA
的方法
。
它包括逆轉錄
(RT)
步驟，以從可能存在于測試樣品中的
miRNA
產生
cDNAr/>，以及定量聚合酶鏈反應
(qPCR)
步驟，以擴增在前一步驟中產生的
cDNA。
[0003]目前的標準
RT
和
qPCR
測定程序需要許多移液和混合步驟來制備和分配試劑
。
通常，
RT
反應需要
10
個步驟，
qPCR
反應需要4個步驟
。
這些許多移液步驟和所需的樣品處理提高了錯誤的風險，例如在擴增過程中產生假陽性，或者如果在這些方法中涉及的多個步驟之一期間
RNA
酶被意外引入到反應混合物中，則可能發生檢測的缺失
。
重要的是防止這些錯誤的發生，特別是在需要標記物的準確定量的診斷背景下
。
此外，減少移液步驟也會減少操作人員的動手時間
。
附圖說明
[0004]本文提供了解決這些問題的組合物和方法
。
[0005]圖1：測試的不同
RT
預混物的示意圖
。
[0006]圖2：測試的不同
qPCR
預混物的示意圖
。
[0007]圖3至5：將四種
RT
預混物在
?
20℃
下一個月后使用
miR34a
陽性對照
(C1
高
、C2
中和
C3
低
)
進行測試，并與經典制劑進行比較
。
[0008]圖6至8：將四種
RT
預混物在
?
20℃
下6個月后使用
miR34a
陽性對照
(C1
高
、C2
中和
C3
低
)
進行測試，并與經典制劑進行比較
。
[0009]圖9至
11
：將四種
qPCR
預混物在
?
20℃
下一個月后使用陽性
miR34a
陽性對照
(C1
高
、C2
中和
C3
低
)
進行測試，并與經典制劑進行比較
。
[0010]圖
12
至
14
：將四種
qPCR
預混物在
?
20℃
下6個月后使用陽性
miR34a
陽性對照
(C1
高
、C2
中和
C3
低
)
進行測試，并與經典制劑進行比較
。
具體實施方式
[0011]本專利技術涉及可用于實踐檢測
miRNA、
優選為
hsa
?
miR
?
34a
?
5p
的
RT
?
qPCR
方法的組合物
。
[0012]逆轉錄酶預混物
[0013]本專利技術的第一方面涉及第一組合物，其在后文中被稱為“RT
預混物”。
本專利技術的
RT
預混物包含下述組分或由下述組分組成：
[0014]?
含有
dATP、dTTP、dCTP
和
dGTP
的脫氧核糖核苷酸三磷酸
(dNTP)
混合物；
[0015]?
適合于特異性引發測試樣品中待定量檢測的感興趣的
miRNA
的逆轉錄的序列特異性引物；
[0016]?
適合于特異性引發用于標準化所述感興趣的
miRNA
的量的對照
miRNA
的逆轉錄的序列特異性引物；
[0017]?
逆轉錄緩沖液；
[0018]?
Tris
?
EDTA
緩沖液；和
[0019]?
無核酸酶水
。
[0020]在特定實施方式中，在添加到預混物之前所述
dNTP
混合物的每種
dNTP
具有
25mM
的濃度
。
在又一個實施方式中，在所述
RT
預混物中每種
dNTP
的終濃度在
500
至
1000
μ
M
之間
。
在特定實施方式中，在所述
RT
預混物中每種
dNTP
的終濃度為
850
μ
M。
[0021]在特定實施方式中，所述感興趣的
miRNA
是
miR
?
34
，特別是
hsa
?
miR
?
34a
?
5p
，其核酸序列由
5'
?
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
?
3'(SEQ ID NO
：
1)(
在
miRBase
中的登記號：
MIMAT0000255)
組成
。
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【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.
一種用于定量檢測樣品中的微小
RNA(miRNA)
的方法，所述方法包括：
(a)
逆轉錄
(RT)
反應，其中將含有
RNA
的測試樣品中的
RNA
逆轉錄成互補
DNA(cDNA)
，其中將
RT
預混物與逆轉錄酶
、RNA
酶抑制劑和所述含有
RNA
的測試樣品混合；其中所述
RT
預混物包含：
?
含有
dATP、dTTP、dCTP
和
dGTP
的脫氧核糖核苷酸三磷酸
(dNTP)
混合物；
?
適合于特異性引發測試樣品中待定量檢測的感興趣的
miRNA
的逆轉錄的序列特異性引物；
?
適合于特異性引發用于標準化所述感興趣的
miRNA
的量的對照
miRNA
的逆轉錄的序列特異性引物；
?
逆轉錄緩沖液；
?
Tris
?
EDTA
緩沖液；和
?
無核酸酶水；和
(b)
定量聚合酶鏈反應
(qPCR)
，以擴增在步驟
(a)
時獲得的
cDNA
，其中將
qPCR
預混物與
PCR
主混合物
、
無核酸酶水和所述在步驟
(a)

【專利技術屬性】
技術研發人員：祖海爾，
申請(專利權)人：基恩菲特公司，
類型：發明
國別省市：