抑制制造技術

本發明專利技術提供了一種靶向微管蛋白

【技術實現步驟摘要】
抑制TUBB2基因表達的干擾RNA及其應用


[0001]本專利技術涉及分子生物學與生物醫藥
，具體涉及一種有效抑制
TUBB2
表達的干擾
RNA
，特別是
siRNA
，及其應用
。

技術介紹

[0002]微管蛋白是構成真核細胞骨架的重要部分，廣泛存在于活細胞的微管中
。
微管是組成真核細胞骨架的基本元素，主要由微管蛋白
α
和
β
聚合而成
。
在正常情況下，微管和微管蛋白二聚體之間存在動態平衡
。
微管在細胞支持和細胞運動中起著至關重要的作用，可以幫助細胞抵抗壓縮力，使其能夠保持其預期的形狀和結構；此外，微管對于細胞運動
、
有絲分裂期間的染色體分離以及細胞器的細胞內運輸等過程同樣至關重要
。
[0003]在人類中，微管蛋白有五個亞組：
α
?
微管蛋白
、
β
?
微管蛋白
、
γ
?
微管蛋白
、
δ
和
ε
?
微管蛋白以及
ζ
?
微管蛋白
。
β
?
微管蛋白特別令人感興趣，因為它形成了一種僅在神經元中表達的微管
。
此外，所有與人微管蛋白結合的藥物也與
β
?
微管蛋白結合，使其成為一種治療靶點/>。
[0004]抗有絲分裂化療藥物以微管蛋白為靶點，微管蛋白是有絲分裂紡錘體中的主要蛋白質，微管蛋白亞型組成被認為是腫瘤進展診斷和細胞對化療反應的決定因素
。
這意味著正常組織和腫瘤組織的亞型組成是不同的，為腫瘤的化療藥物的開發提供了理論基礎
。
目前常見的抗微管蛋白藥物有長春堿
、
紫杉醇等
。
其中，紫杉醇可使微管與微管蛋白二聚體之間失去動態平衡，誘導和促進微管蛋白聚合，防止解聚，穩定微管
。
長春堿主要抑制微管蛋白的聚合，而妨礙紡錘體微管的形成，使核分裂停止于中期；也可引起核崩潰，呈空泡式固縮；作用于細胞膜，干擾細胞膜對氨基酸的運轉，使蛋白質的合成受抑制；可通過抑制
RNA
聚合酶的活力而抑制
RNA
的合成，將細胞殺滅于
G1
期
。
這些作用導致細胞在進行有絲分裂時不能形成紡錘體和紡錘絲，抑制了細胞分裂和增殖，從而發揮抗腫瘤作用
。
因此，通過抑制或促進微管蛋白聚合，干擾微管的平衡，從而影響細胞的有絲分裂，抑制細胞增殖
。
[0005]β2微管蛋白存在于細胞核，也可以非微管形式存在，可以顯著影響細胞的行為
。
β2微管蛋白參與了幾種類型腫瘤的發生發展，如神經上皮瘤和腦腫瘤
、
結腸癌和前列腺癌
。
在侵襲性轉移瘤中，發現了位于細胞核的
β2微管蛋白，暗示其可以與抗微管藥紫杉醇和長春堿相互作用
。
細胞質中沒有被裝配到微管中的
β2微管蛋白可以與電壓依賴性陰離子通道
(VDAC)
相互作用，為肌肉細胞提供能量
。
研究發現，
β2微管蛋白的過表達與結腸直腸癌患者較短的預期壽命相關
。
β2微管蛋白定位于細胞核的腫瘤患者的預期壽命甚至更短
。
[0006]因此，本申請篩選出抑制活性較高的干擾
RNA
序列，有望制備成
RNA
藥物，用于治療腫瘤
。
另外，
siRNA
分子較大，帶有大量負電荷，很難通過同樣帶負電荷的細胞膜
。
因此尋找合適的遞送系統是開發
siRNA
藥物過程中重要的一部分，本申請提供了脂質納米顆粒
(lipid nanoparticles
，
LNP)
和抗體偶聯
siRNA(Antibody
–
siRNA conjugates
，
ARC)
兩種可行的遞送方式
。

技術實現思路

[0007]本專利技術的第一方面，提供了一種靶向微管蛋白
β
2(TUBB2)
基因的干擾
RNA。
[0008]所述的干擾
RNA
抑制
TUBB2
的表達
。
[0009]所述干擾
RNA
的靶位點序列包含
SEQ ID NO
：1?
13
中的任一個或兩個以上所示的核苷酸序列
。
優選的，所述干擾
RNA
的靶位點序列如
SEQ ID NO
：1?
13
中的任一個核苷酸序列所示
。
[0010]優選的，所述干擾
RNA
的靶位點序列包含
SEQ ID NO
：1?
10
或
12
中的任一個或兩個以上所示的核苷酸序列
。
優選的，所述干擾
RNA
的靶位點序列如
SEQ ID NO
：1?
10
或
12
中的任一個核苷酸序列所示
。
[0011]進一步優選的，所述干擾
RNA
的靶位點序列包含
SEQ ID NO
：1?3或5?6或8?
10
中的任一個或兩個以上所示的核苷酸序列
。
優選的，所述干擾
RNA
的靶位點序列如
SEQ ID NO
：1?3或5?6或8?
10
中的任一個核苷酸序列所示
。
[0012]在本專利技術的一個具體實施方式中，所述干擾
RNA
的靶位點序列包含
SEQ ID NO
：
2、8
和
/
或
10。
所述的干擾
RNA
包含
siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA
或
miRNA
中一種或兩種以上的組合
。
[0013]在本專利技術的一個具體實施方式中，所述的干擾
RNA
為
siRNA。
[0014]所述干擾
RNA
的長度為
17
?
25nt
，優選
19
?
21nt
，例如
17、18、19、20、21、22、23、24、25nt。
[0015]所述干擾
RNA
還包括懸掛堿基，本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.
一種靶向
TUBB2
基因的干擾
RNA
，其特征在于，所述干擾
RNA
的靶位點序列包含
SEQ ID NO
：1?
13
中的任一個或兩個以上所示的核苷酸序列
。2.
根據權利要求1所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述的干擾
RNA
包含
siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA
或
miRNA
中一種或兩種以上的組合；優選的，所述的干擾
RNA
為
siRNA。3.
根據權利要求1或2所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述干擾
RNA
還包括懸掛堿基；優選的，所述的干擾
RNA
包含1?
10
個懸掛堿基
。4.
根據權利要求3所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述的懸掛堿基位于所述的干擾
RNA
的正義鏈和
/
或反義鏈的3’
末端
。5.
根據權利要求3或4所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述的懸掛堿基為脫氧核苷；優選的，所述的懸掛堿基為
dTdT、dTdC
或
dUdU。6.
根據權利要求1?5任一所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述的干擾
RNA
包含正義鏈和
/
或反義鏈；優選的，所述的正義鏈包含
SEQ ID NO
：
14
?
26
中的任一個或兩個以上所示的核苷酸序列；優選的，所述的反義鏈包含
SEQ ID NO
：
27
?
39
中的任一個或兩個以上所示的核苷酸序列
。7.
根據權利要求1?6任一所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述干擾
RNA
還包括至少一種修飾；所述的修飾包括在堿基
、
糖環和
/
或磷酸骨架上進行的修飾；優選的，堿基的修飾包括但不限于5位嘧啶修飾
、8
位嘌呤修飾
、
假尿嘧啶修飾和
/
或5?
溴尿嘧啶取代；優選的，所述的糖環的修飾包括但不限于
2'
?
OH
被
H、OZ、Z、halo、SH、SZ、NH2、NHZ、NZ2或
CN
基團取代，其中
Z
為烷基基團；優選的，所述的磷酸骨架修飾包括但不限于硫代磷酸修飾
。8.
根據權利要求7所述的干擾
RNA
，其特征在于，所述的修飾還包括具有肌苷
、
辮苷
、
黃嘌呤
、2'
?
甲基核糖
、
非天然磷酸二酯鍵
(
如甲基膦酸酯
、
硫代膦酸酯
)
和
/
或肽的核苷酸
。9.
一種權利要求1?8任一所述的干擾
RNA
的遞送系統，其特征在于，所述的遞送系統包含權利要求1?8任一所述的干擾
RNA
和載體
。10.
根據權利要求9所述的遞送系統，其特征在于，所述的載體為病毒載體或非病毒載體；優選的，所述病毒載體包括：慢病毒載體
、
逆轉錄病毒載體
、
腺病毒載體
、
腺相關病毒載體
、
痘病毒載體或皰疹病毒載體中的一種或兩種及以上的組合；優選的，所述非病毒載體包括：脂質體
、
脂質納米顆粒
、
聚合物
、
多肽
、
抗體
、
適配體或
N
?
乙酰半乳糖胺
(GalNAc)
中任一種或兩種及以上的組合
。11.
根據權利要求
10
所述的遞送系統，其特征在于，所述脂質納米顆粒
/
脂質體包括：陽離子脂質
、
中性脂質
、
聚乙二醇脂質
、
甾族脂質或陰離子脂質中的一種或兩種以上組合
。12.
根據權利要求
11
所述的遞送系統，其特征在于，所述陽離子脂質包括：十八酰胺
(SA)、
溴化月桂基三甲基銨
、
溴化十六烷基三甲基銨
、
溴化肉豆蔻基三甲基銨
、
溴化二甲基二
?
十八銨
(DDAB)、[(4
?
羥基丁基
)
氮雜二烷基
]
雙
(
己烷
?6，1?
二基
)
雙
(2
?
己基癸酸酯
)
(ALC
?
0315)、1,2
?
二油酰基氧基
?3?
(
三甲基銨基
)
丙烷
(DOTAP)、1,2
?
二
?
(9Z
?
十八烯酰基
)
?3?
三甲基銨
?
丙烷和
1,2
?
二
?
十六酰基
?3?
三甲基銨
?
丙烷
、3
β
?
[N
?
(N',N'
?
二甲基氨基乙烷
)
?
氨基甲酰基
]
膽固醇
(DC
膽固醇
)、
二甲基二十八烷基銨
(DDA)、1,2
?
二肉豆蔻酰基
?3?
三甲基銨丙烷
(DMTAP)、
二棕櫚酰
(C16:0)
三甲基銨丙烷
(DPTAP)、
二硬脂酰基三甲基銨丙烷
(DSTAP)、N
?
[1
?
(2,3
?
二烯丙氧基
)
丙基
]
?
N,N,N
?
三甲基氯化銨
(DOTMA)、N,N
?
二油酰基
?
N,N
?
二甲基氯化銨
(DODAC)、1,2
?
二油酰基
?
sn
?
丙三氧基
?3?
乙基磷酸膽堿
(DOEPC)、1,2
?
二油酰基
?3?
二甲基銨丙烷
(DODAP)、1,2
?
二亞油基氧基
?3?
二甲基氨基丙烷
(DLinDMA)、1,2
?
二
?
十四酰基
?3?
二甲基銨
?
丙烷
、1,2
?
二
?
十六酰基
?3?
二甲基銨
?
丙烷和
1,2
?
二
?
十八酰基
?3?
二甲基銨
?
丙烷
、1,2
?
二油酰基
?
c
?
(4'
?
三甲基銨
)
?
丁酰基
?
sn
?
甘油
(DOTB)、
二
?
十八酰胺
?
丙氨酰基精胺
、SAINT
?
2、
聚陽離子脂質
2,3
?
二油酰基氧基
?
N
?
[2(
精胺
?
羧酰氨基
)
乙基
]
?
N,N
?
二甲基
?1?
丙銨三氟乙酸鹽
(DOSPA)、
中的一種或兩種以上的組合
。13.
根據權利要求
11
所述的遞送系統，其特征在于，所述中性脂質包括：
1,2
?
二硬脂酰
?
sn
?
甘油
?3?
磷酸膽堿
(DSPC)、1,2
?
二棕櫚酰
?
sn
?
甘油
?3?
磷酸膽堿
(DPPC)、1,2
?
二油酰
?
sn
?
甘油
?3?
磷酸乙醇胺
(DOPE)、1,2
?
二棕櫚酰
?
sn
?
甘油
?3?
磷酸乙醇胺
(DPPE)、1,2
?
二肉豆蔻酰...

【專利技術屬性】
技術研發人員：賈宏麗，林美娜，楊脈，陳曉萌，趙宣，
申請(專利權)人：北京鍵凱科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：