【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種利用全細胞轉化高效生產α-酮戊二酸的方法，屬于分子生物技術與酶工程。
技術介紹
1、α-酮戊二酸是生物體是三羧酸循環中重要的二羧酸，可通過谷氨酸脫氫酶或轉氨酶生成谷氨酸，在食品、醫療、化妝品、精細化工等領域有著廣泛應用。由于市場需求大于供給，價格較高。目前合成α-酮戊二酸主要有三種方法：化學合成法、發酵積累法和酶法轉化。
2、化學合成的方法有酰基腈化物水解法和草酸類乙酯水解法，該法合成路線冗長、總收率低及污染嚴重；發酵積累法使用葡萄糖培養光滑球擬酵母積累α-酮戊二酸，64h達到43.7g/l，難以實現工業化生產；雖然有研究報道使用甘油培養解脂耶氏酵母，發酵117h后α-酮戊二酸的產量可達到186g/l，但是發酵周期過長，副產物過多使得下游分離純化難度大，工業化生產成本較高，工藝控制較為復雜。酶法轉化合成α-酮戊二酸具有成本低、反應條件溫和、分離純化簡單等特點，具有廣闊的工業化開發前景。
技術實現思路
1、針對化學制備α-酮戊二酸的方法中，存在產品雜質過多，不易精制，后處理步驟繁瑣，成本高等問題，不適合工業上大規模生產，本專利技術公開了一種利用全細胞轉化高效生產α-酮戊二酸的方法，并利用l-氨基酸氧化酶改造一定程度上提高了α-酮戊二酸的產量和轉化率，構建了以大腸桿菌為宿主的高產α-酮戊二酸的工程菌。本專利技術通過在大腸桿菌細胞中異源表達合成α-酮戊二酸的關鍵酶并進行改造。最后，通過全細胞催化體系的優化，實現了酮異戊酸的高效生產。本研究為開發大規模生產α-
2、本專利技術提供了一種l-氨基酸氧化酶的突變體，所述突變體是在野生型l-氨基酸氧化酶的第134位、第317位、第319位、第566位的氨基酸中的一個或多個進行突變；所述野生型l-氨基酸氧化酶的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。
3、在本專利技術的一種實施方式中，將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，并將第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，并將第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的。
4、在本專利技術的一種實施方式中，所述突變體為e134l，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
5、在本專利技術的一種實施方式中，所述突變體為s317t，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示；
6、在本專利技術的一種實施方式中，所述突變體為i319l，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示；
7、在本專利技術的一種實施方式中，所述突變體為h566l，其核苷酸序列如seq?id?no.5所示；
8、在本專利技術的一種實施方式中，所述突變體為s317t/h566l，其核苷酸序列如seq?idno.6所示。
9、在本專利技術的一種實施方式中，編碼所述親本酶l-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
10、本專利技術還提供了編碼上述突變體的基因。
11、本專利技術還提供了攜帶上述基因的重組載體。
12、在本專利技術的一種實施方式中，所述重組載體是以pet-28a(+)為表達載體。
13、本專利技術還提供了表達上述突變體，或攜帶上述基因，或含有上述重組載體的重組細胞。
14、在本專利技術的一種實施方式中，所述重組細胞是以細菌或真菌為表達宿主。
15、在本專利技術的一種實施方式中，所述重組細胞是以escherichia?coli?bl21(de3)為表達宿主。
16、本專利技術還提供了一種高效生產α-酮戊二酸的重組大腸桿菌。
17、在本專利技術的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌是以pet-28a(+)質粒為表達載體。
18、在本專利技術的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌表達了上述l-氨基酸氧化酶或上述l-氨基酸氧化酶突變體，所述l-氨基酸氧化酶或l-氨基酸氧化酶突變體位于pet-28a(+)質粒上。
19、在本專利技術的一種實施方式中，所述l-氨基酸氧化酶選自粘液變形桿菌，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
20、在本專利技術的一種實施方式中，所述大腸桿菌為escherichia?coli?bl21(de3)。
21、本專利技術提供了一種獲得所述l-氨基酸氧化酶svlgox突變體的方法，所述方法包括：
22、(1)在粘液變形桿菌l-氨基酸氧化酶svlgox氨基酸序列的基礎上確定突變位點；設計定點突變的引物，以攜帶l-氨基酸氧化酶svlgox基因的載體為模板進行定點突變；構建含所述突變體的重組質粒；
23、(2)將突變體質粒轉化進宿主細胞；
24、(3)挑選陽性克隆進行發酵培養、誘導，進而獲得svlgox突變體的蛋白，用于后續轉化實驗。
25、本專利技術還提供了一種全細胞催化劑，所述全細胞催化劑含有上述重組大腸桿菌。
26、本專利技術還提供了一種以自來水為溶劑的全細胞轉化體系的催化制備α-酮戊二酸的方法。
27、在本專利技術的一種實施方式中，所述轉化的體系包括l-谷氨酸(鈉)濃度為90～110g/l，反應中無需添加緩沖液，反應體系中是以自來水為溶劑。
28、在本專利技術的一種實施方式中，所述反應體系中添加0.5mm經iptg誘導22～24h的上述重組大腸桿菌或全細胞催化劑。
29、在本專利技術的一種實施方式中，所述轉化的全細胞催化劑濃度為20～45g/l，最優的全細胞催化劑濃度為45g/l。
30、在本專利技術的一種實施方式中，所述轉化的ph為6.5～8.5，最優的ph為7.5。
31、在本專利技術的一種實施方式中，所述轉化的溫度為30～45℃，最優的溫度為40℃。
32、在本專利技術的一種實施方式中，所述轉化時間為12～48h，最優的時間為36h。
33、本專利技術提供了一種所述重組大腸桿菌和全細胞催化劑在制藥、食品或化工領域中的應用。
34、本專利技術還提供了一種提高l-氨基酸氧化酶酶活的方法本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種L-氨基酸氧化酶突變體，其特征在于，所述突變體是將氨基酸序列如SEQ?IDNO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第134位、第317位、第319位、第566位的氨基酸中的一個或多個進行突變得到的。
2.根據權利要求1所述的L-氨基酸氧化酶突變體，其特征在于，所述突變體為，將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸得到的；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，并
3.編碼權利要求1或2所述的L-氨基酸氧化酶突變體的基因。
4.攜帶權利要求3所述基因的重組載體。
5.表達了權利要求1或2所述的突變體，或攜帶了權利要求3所述的基因，或攜帶權利要求4所述重組載體的重組細胞。
6.根據權利要求5所述的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是以細菌或真菌為表達宿主。
7.一種提高L-氨基酸氧化酶酶活的方法，其特征在于，所述方法為，將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第566位的組氨酸突變為亮氨酸；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸；或將氨基酸序列如SEQ?IDNO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，并將第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸；或將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示的L-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，并將第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸。
8.一種制備α-酮戊二酸的方法，其特征在于，所述方法為，以權利要求1或2所述的L-氨基酸氧化酶突變體，或以權利要求5或6所述的重組細胞為催化劑，催化L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉制備得到α-酮戊二酸。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法為，將所述L-氨基酸氧化酶突變體或重組細胞添加至含有90～110g/L?L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉的轉化體系中，轉化體系的溶劑為自來水，在通氣量為1.5～3vvm的條件下進行反應制備得到α-酮戊二酸。
10.權利要求1或2所述的L-氨基酸氧化酶突變體，或權利要求3所述的基因，或權利要求4所述的重組載體，或權利要求5或6所述的重組細胞在制備α-酮戊二酸或含有α-酮戊二酸的化學品中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種l-氨基酸氧化酶突變體，其特征在于，所述突變體是將氨基酸序列如seq?idno.7所示的l-氨基酸氧化酶的第134位、第317位、第319位、第566位的氨基酸中的一個或多個進行突變得到的。
2.根據權利要求1所述的l-氨基酸氧化酶突變體，其特征在于，所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第134位的谷氨酸突變為亮氨酸，并將第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的；或將氨基酸序列如seq?id?no.7所示的l-氨基酸氧化酶的第317位的絲氨酸突變為蘇氨酸，并將第319位的異亮氨酸突變亮氨酸，同時將第566位的組氨酸突變為亮氨酸得到的。
3.編碼權利要求1或2所述的l-氨基酸氧化酶突變體的基因。
4.攜帶權利要求3所述基因的重組載體。
5.表達了權利要求1或2所述的突變體，或攜帶了權利要求3所述的基因，或攜帶權利要求4所述重組載體的重組細胞。
6.根據權利要求5所述的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是以細菌或真菌為表達宿主。
7.一種提高l-氨基酸氧...
【專利技術屬性】
技術研發人員：饒志明，王玥，韓瑾，徐美娟，楊套偉，張顯，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。