本發(fā)明專利技術(shù)屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種膿毒癥血樣中乳酸的氣質(zhì)聯(lián)用前處理方法。具體步驟為：將冰凍儲存的血樣在常溫下自然解凍；自然解凍后的血樣中加入過氯酸，充分振蕩，蛋白沉淀后離心，取上清液；在所得上清液中加入堿溶液，中和至ｐＨ６－７，離心取上清液；上清液通過陰離子交換柱；用去離子水充分清洗陰離子交換柱后，用乙酸洗脫陰離子交換柱，收集洗脫液；洗脫液用氮吹儀吹干，加入雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，吡啶，乙酸乙酯，密封；微波反應(yīng)；控制微波功率為２００Ｗ－８００Ｗ，微波反應(yīng)時間為３０ｓ－１２０ｓ。本發(fā)明專利技術(shù)節(jié)約了ＧＣ／ＭＳ前處理的時間，便于進行大量血樣中乳酸的快速分析，同時也有利于在臨床上開展膿毒癥的營養(yǎng)支持治療。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種膿毒癥血樣中乳酸的氣質(zhì)聯(lián)用前處理方 法。
技術(shù)介紹
由感染、燒傷、創(chuàng)傷、缺血再灌注等引起的膿毒癥在臨床上非常多見，是一種病 情非常嚴重而且非常復(fù)雜的臨床病癥。膿毒癥在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高， 據(jù)研究膿毒癥的死亡率在30%至60%之間. MMWR Morb Mortal ffkly Rep. 1990,39 31-34. Angus DC,Linde-Zwirble WT,Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR. , Epidemiology of severe sepsis in the United States :analysis of incidence, outcome,and associatedcosts of care. Crit Care Med.，2001，29 :1303-1310.]。每年在美國有750，000人受到膿毒癥的感染，即使在發(fā)達國 家膿毒癥也有超過 35% 的死亡率. Seminars in respiratory and critical care medicine,2004, 25(6) :611-618]。膿毒癥誘發(fā)的膿毒性休克(S印tic shock)和多器官功能不全綜合癥 (Multiple organ dysfunction syndrom，M0DS)，是當前外科危重病患者的主要死亡原因之 一 ，ANNALS OF MEDICINE 1995,27(1) :13_20.]。膿毒癥已 經(jīng)成為醫(yī)學(xué)上的一大主要難題，尤其是重癥監(jiān)護室(I⑶)面臨的最大難題之一，目前已經(jīng) 投入了很多資源在研究和治療這一疾病上, N Engl JMed，1999，340 :207_214]。在膿毒癥發(fā)生時，機體體現(xiàn)高代謝狀態(tài)，研究體內(nèi)的營養(yǎng)代謝有助于膿毒癥的營 養(yǎng)支持治療。支持治療需要根據(jù)病情給膿毒癥病人補充高熱量、高蛋白、多種氨基酸等營 養(yǎng)物質(zhì)。支持治療會影響到膿毒癥的治療效果。近年來，國際上對膿毒癥發(fā)病機理的研究 發(fā)現(xiàn)，當病人處于膿毒癥時，臨床上機體處于復(fù)雜激烈的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)，都表現(xiàn)為高代謝狀 態(tài)、高血流動力學(xué)狀態(tài)及其他的炎性反應(yīng)征象。在高代謝狀態(tài)下，機體組織蛋白質(zhì)發(fā)生自身 分解和對外源性營養(yǎng)物產(chǎn)生不應(yīng)性，靠單純補充外源性營養(yǎng)物，并不能有效阻止自身的消 耗，機體出現(xiàn)自噬代謝(Auto connibalism)。因此，在對膿毒癥患者尤其是膿毒癥危重患者 開展營養(yǎng)物質(zhì)的支持治療時，研究營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑和代謝過程非常重要。在膿毒癥發(fā) 生時，血液中乳酸的代謝情況對膿毒癥的營養(yǎng)支持治療能起到非常重要的指導(dǎo)作用。傳統(tǒng)方法乳酸的氣質(zhì)聯(lián)用檢測中由于乳酸前處理花費的時間比較長，至少需要30 分鐘，對血漿樣品處理來說，衍生化反應(yīng)耗時長，加上所需的血樣分離時間，整個前處理時 間過長，不利于乳酸的快速檢測。對于膿毒癥的臨床監(jiān)測來說，需要找到一種快速檢測血樣中乳酸的方法，改進血 樣中乳酸的前處理方法，對臨床治療意義重大。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供。本專利技術(shù)提出的，具體步驟如下(1)將冰凍儲存的血樣在常溫下自然解凍；(2)自然解凍后的血樣中加入過氯酸，充分振蕩，蛋白沉淀，離心，取上清液；(3)在步驟(2)的血清上清液中加入堿溶液，中和至pH為6-7，離心取上清液；(4)上清液通過陰離子交換樹脂柱；(5)用去離子水充分清洗陰離子交換樹脂柱后，用乙酸洗脫陰離子交換樹脂柱，收 集洗脫液；(6)洗脫液用氮吹儀吹干，加入雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)、吡啶和乙 酸乙酯，密封；微波反應(yīng)，控制微波功率為200W-800W，反應(yīng)時間30s-120s。本專利技術(shù)中，步驟(2)中所使用的過氯酸體積比濃度為8%。本專利技術(shù)中，步驟(3)中所使用的堿溶液采用氫氧化鉀(K0H)。本專利技術(shù)中，步驟(4)中所使用的陰離子交換樹脂可以采用cr型樹脂。本專利技術(shù)中，步驟(5)中所使用的乙酸為2mol/l。本專利技術(shù)中，為了微波更好地吸收，步驟(6)中還可以加入乙腈做微波吸收劑。本專利技術(shù)中，控制微波功率為400-450W，微波反應(yīng)時間為100_120s。本專利技術(shù)的有益效果是膿毒癥血樣中乳酸的氣質(zhì)聯(lián)用前處理方法可以將衍生化反 應(yīng)時間從傳統(tǒng)前處理方法的30至90分鐘縮短到2分鐘，節(jié)約了氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)前處理 的時間，便于進行大量血樣中乳酸的快速分析，同時也有利于在臨床上開展膿毒癥的營養(yǎng) 支持治療。附圖說明圖1是實施例1膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化反應(yīng)的GC/MS總離子流色譜圖；圖2是實施例1膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化反應(yīng)的GC/MS質(zhì)譜圖；圖3是實施例2膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化GC/MS總離子流色譜圖(微波功率 200W)；其中曲線(a)為30秒鐘，(b)為60秒鐘，(c)為120秒鐘；圖4是實施例2膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化GC/MS總離子流色譜圖(微波功率 400W)；其中曲線(a)為30秒鐘，(b)為60秒鐘，(c)為120秒鐘；圖5是實施例2膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化GC/MS總離子流色譜圖(微波功率 600W)；其中曲線(a)為30秒鐘，(b)為60秒鐘，(c)為120秒鐘；圖6是實施例2膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化GC/MS總離子流色譜圖(微波功率 800W)；其中曲線(a)為30秒鐘，(b)為60秒鐘，(c)為120秒鐘。具體實施例方式下面的實施例是對本專利技術(shù)的進一步說明，而不是限制本專利技術(shù)的范圍。實施例1膿毒癥血樣中乳酸微波衍生化反應(yīng)(1)血樣來源——膿毒癥動物實驗4新西蘭兔飼養(yǎng)在可控環(huán)境下，暴露于12 12小時白天/黑夜循環(huán)，提供標準的 兔食，隨意供水，動物實驗前至少習(xí)慣環(huán)境一星期。動物實驗開始時，動物用塞拉嗪(4mg/ kg)和氯胺酮肌肉注射麻醉后，無菌條件下在左側(cè)頸內(nèi)靜脈和頸動脈分別置入PE 90聚乙 烯導(dǎo)管(帶1cm硅橡膠頭)，再分別向下放至右心房和主動脈弓，導(dǎo)管用肝素_生理鹽水 (100U肝素/mi)灌注。為了獲得肝臟來源的葡萄糖凈流出量絕對值，還將測量內(nèi)臟區(qū)域的 血流量。開腹后分別在肝總靜脈、門靜脈和一條腸系膜靜脈中分別置入PE 90聚乙烯導(dǎo)管 (帶1cm硅橡膠頭)。創(chuàng)傷手術(shù)后進行內(nèi)毒素(LPS)灌注，采用靜脈輸液泵控制LPS滴速， 以10ng kg"1 mirT1的速率輸入，誘導(dǎo)兔的膿毒癥-高代謝-高動力性狀態(tài)。在灌注實驗前，從兔頸靜脈中抽取血樣2ml。灌注實驗進行120分鐘開始每隔10 分鐘從頸靜脈抽取血樣2ml，此時兔體內(nèi)代謝達到動態(tài)平衡，同位素豐度比基本穩(wěn)定，即達 到坪段豐度，分析此時同位素豐度比可以用來計算體內(nèi)代謝的動力學(xué)系數(shù)。血樣抽取以后，立即注入加有肝素的試管中。肝素是一種含硫酸鹽的粘多糖(常 用其鈉鹽或鉀鹽)，能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白肝 素，是制備血漿時最常用的抗凝劑。1ml的全血中加0. 1 0. 2mg的肝素，血樣注入試管后 需要立即輕輕旋搖，但不能太猛烈，以免導(dǎo)致血細胞破裂造成溶血(溶血產(chǎn)生的血色素可 能會給分析帶來影響)。加入肝素的全血及時離心，若不及時分離，冰凍保存時會引起細胞 溶解，而阻礙血漿的分離，同時因溶血而影響血樣的分析。血漿樣品在-20°本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種膿毒癥血樣中乳酸的氣質(zhì)聯(lián)用前處理方法，其特征在于具體步驟如下：（１）將冰凍儲存的血樣在常溫下自然解凍；（２）自然解凍后的血樣中加入過氯酸，充分振蕩，蛋白沉淀，離心，取上清液；（３）在步驟（２）的血清上清液中加入堿溶液，中和至ｐＨ為６－７，離心取上清液；（４）上清液通過陰離子交換柱；（５）用去離子水充分清洗陰離子交換柱后，用乙酸洗脫陰離子交換柱，收集洗脫液；（６）洗脫液用氮吹儀吹干，加入雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺、吡啶和乙酸乙酯，密封；微波反應(yīng)，控制微波功率為２００Ｗ－８００Ｗ，微波反應(yīng)時間為３０ｓ－１２０ｓ。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖晉芬，宋國新，胡耀銘，
申請(專利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：31[中國|上海]
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。