抗諾氟沙星多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種抗諾氟沙星多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。該抗體是通過以下方法制備的：ａ）免疫原的制備：以諾氟沙星為半抗原，通過Ｎ－羥基琥珀酰亞胺活性酯法（ＮＨＳ）將諾氟沙星與牛血清蛋白（ＢＳＡ）偶聯(lián)，得到免疫原；ｂ）多克隆抗體的制備：將免疫原免疫動物，取動物血清，用免疫球蛋白Ａ親和層析法對血清進(jìn)行純化，最后獲得的抗體，即為抗諾氟沙星多克隆抗體。該抗諾氟沙星多克隆抗體具有單一性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、并且能長期保存，能高效結(jié)合諾氟沙星的優(yōu)點(diǎn)，因此可應(yīng)用于檢測諾氟沙星在水環(huán)境中的殘留。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及免疫學(xué)和環(huán)境分析化學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種特異性捕獲諾 氟沙星藥物殘留的抗諾氟沙星多克隆抗體及其制備方法，和該抗諾氟沙星多克隆抗體在檢 測天然淡水和污水中諾氟沙星藥物殘留中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
諾氟沙星藥物屬于氟喹諾酮類抗生素，是一種用于治療人類細(xì)菌感染的廣譜抗生 素。由于氟喹諾酮類抗生素的大量使用，諾氟沙星已經(jīng)成為氟喹諾酮類在環(huán)境中殘留的主 要抗生素之一。抗生素的濫用會導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使到細(xì)菌感染更加難以控制。另一 方面，諾氟沙星對人體的潛在毒理影響尚未清楚。因此，監(jiān)測環(huán)境中的諾氟沙星藥物殘留具 有重要意義。目前，尚無一種快速、廉價的方法對水環(huán)境中的諾氟沙星進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)的高 效液相色譜法不僅樣品前處理復(fù)雜，并且費(fèi)用昂貴，推廣使用受到限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的第一個目的是提供一種能與諾氟沙星特異性結(jié)合的抗諾氟沙星多克隆 抗體及其制備方法。本專利技術(shù)的能與諾氟沙星特異性結(jié)合的抗諾氟沙星多克隆抗體是通過以下方法制 備的a)免疫原的制備以諾氟沙星為半抗原，通過N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法(NHS) 將諾氟沙星與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)，得到免疫原；b)多克隆抗體的制備將免疫原免疫動物，取動物血清，用免疫球蛋白A親和層析 法對血清進(jìn)行純化，最后獲得的抗體，即為抗諾氟沙星多克隆抗體。利用上述方法制備的抗諾氟沙星多克隆抗體在4°C冰箱中能夠保存2年。經(jīng)冷凍 干燥后，該抗體在-20 °C冰箱中能夠長期保存，年限在15年以上。所述的動物優(yōu)選為新西蘭大白兔，利用上述方法制備的兔多克隆抗體，該抗體效 價達(dá)到1 1024000倍。本專利技術(shù)的第二個目的是提供抗諾氟沙星多克隆抗體在檢測諾氟沙星中的應(yīng)用。本專利技術(shù)所述的抗諾氟沙星多克隆抗體在檢測諾氟沙星中的應(yīng)用，其使用方法可為 放射免疫法，酶聯(lián)免疫法和免疫熒光法，其載體可為液相也可以為固相。對于固相載體而 言，可以將本專利技術(shù)的抗諾氟沙星多克隆抗體固定于固相載體上，也可以將包被原固定于固 相載體上。對于液相而言，通常可以向處在特定緩沖體系的待測樣品中直接加入本專利技術(shù)的 抗諾氟沙星多克隆抗體，然后在適于抗原抗體發(fā)生相互作用的溫度(如室溫)進(jìn)行反應(yīng)。免疫檢測中所用的第二抗體可以是放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用選 自32P、125I、35S或2H等；也可以是非放射性同位素標(biāo)記的，包括但不限于使用選自辣根過 氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、鏈酶親和素等標(biāo)記。免疫檢測中使用的檢測劑，取決于檢測 過程使用的第二抗體標(biāo)記物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何選擇合適的檢測試劑。優(yōu)選使用方法為間接競爭酶聯(lián)免疫法，為實(shí)施該方法，本專利技術(shù)還提供了具體實(shí)施 方案，它所使用的試劑包括酶聯(lián)免疫的常規(guī)試劑，酶標(biāo)板和抗諾氟沙星多克隆抗體，所述的 酶標(biāo)板是將諾氟沙星與卵清蛋白通過N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法(NHS)偶聯(lián)，將此偶聯(lián)物 作為包被原吸附于固相載體中而形成的。然后在酶標(biāo)板上加入抗諾氟沙星多克隆抗體工作 液和諾氟沙星樣品溶液，樣品中的諾氟沙星就會與固相載體中的包被原競爭有限的抗諾氟 沙星多克隆抗體。通過洗滌，將結(jié)合了樣品中游離的抗諾氟沙星多克隆抗體洗去，再使用酶 標(biāo)二抗標(biāo)記已經(jīng)與包被原結(jié)合的抗體，顯色后，測定吸光光度值，該值與樣品中諾氟沙星的 含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出諾氟沙星的含量。應(yīng)用本方法可以高效、準(zhǔn)確、簡 便檢測樣品中的諾氟沙星，適于大量樣品篩選的定性、定量檢測。因此本專利技術(shù)的間接競爭酶 聯(lián)免疫方法具有使用方便和成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。利用本專利技術(shù)的抗諾氟沙星多克隆抗體可以檢測污水和天然淡水等樣品，所述的污 水優(yōu)選經(jīng)過前處理，即將污水樣本PH值調(diào)至7. 3-7. 5之間，再使用孔徑為0. 22 y m的膜進(jìn) 行過濾，即可直接進(jìn)行分析。所述的天然淡水的前處理優(yōu)選為將樣本的天然淡水的PH值調(diào) 至7. 3-7. 5之間，使用孔徑為0.22 iim的膜進(jìn)行過濾。取100ml進(jìn)行固相微萃取，用5ml甲 醇淋出，并用氮?dú)獯蹈桑偃?ml pH值為7. 4的磷酸緩沖液重新溶解并稀釋至相應(yīng)的濃縮 倍數(shù)，即可進(jìn)行分析。河水濃縮倍數(shù)優(yōu)選為10倍，湖水優(yōu)選為20倍，井水優(yōu)選為100倍。本專利技術(shù)的抗諾氟沙星多克隆抗體單一性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、并且能長期保 存，能高效結(jié)合諾氟沙星，因此可應(yīng)用于檢測諾氟沙星在水環(huán)境中的殘留。利用本專利技術(shù)的間接競爭酶聯(lián)免疫方法檢測諾氟沙星在天然淡水和污水中的殘留， 具有精確度高、準(zhǔn)確度高、對設(shè)備儀器要求低、成本低、無放射性同位素污染的優(yōu)點(diǎn)，有效填 補(bǔ)了快速檢測天然淡水和污水中諾氟沙星殘留的空白，對日常水環(huán)境監(jiān)測能夠發(fā)揮重要作 用。附圖說明圖1是諾氟沙星與牛血清蛋白(NFX-BSA)偶聯(lián)后的紫外吸光光譜，并與諾氟沙星 (NFX)和牛血清蛋白(BSA)的紫外圖譜作比較；圖2是諾氟沙星檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對本專利技術(shù)的進(jìn)一步說明，而不是對本專利技術(shù)的限制。實(shí)施例1一、抗諾氟沙星多克隆抗體的制備(1)諾氟沙星免疫原的合成a、取9. 6mg諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(可市購)，17. 25mg N_羥基琥珀酰亞胺和57. 5mg EDC. HCL (1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽)，溶于3ml N, N- 二甲基甲酰胺 中。b、室溫避光攪拌24小時，形成諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液。c、取750mg的牛血清蛋白(BSA)溶于8ml (0. 1M，pH 7. 4)的磷酸鹽緩沖液中。d、將諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液在緩慢攪拌下加到牛血清蛋白溶液中，室溫緩慢攪拌反應(yīng)3小時。e、將反應(yīng)完的溶液對(0. lM，pH 7. 4)磷酸鹽緩沖液透析3天，每天更換透析液3_4 次。f、將透析后的反應(yīng)液冷凍干燥，分裝后在_20°C保存。其偶聯(lián)后的紫外吸收光譜見 于圖1(2)動物免疫程序a、采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以上述免疫原，對新西蘭大白兔采取小劑量、 低頻率、長程免疫法進(jìn)行免疫，初次免疫將0. 5mg/kg(即按照每千克新西蘭大白兔注射 0. 5mg免疫原的劑量)免疫原溶在0. 5ml 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl溶液中，再與等體積 的弗氏完全佐劑充分乳化后，進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。b、二免是間隔17天后，使用0. 5mg/kg (即按照每千克新西蘭大白兔注射0. 5mg免 疫原的劑量)諾氟沙星免疫原溶于0. 5ml 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl溶液中，再與等體積 的弗氏不完全佐劑充分乳化后，進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。c、三免、四免、五免、六免都是間隔17天，使用0. 25mg/kg(即按照每千克新西蘭大 白兔注射0. 25mg免疫原的劑量)的諾氟沙星免疫原免疫，其配制方法與二免的注射免疫試 劑相同，只是劑量濃度不同而已。d、七免是六免17天后，使用0. 25mg/kg(即按照每千克新西蘭大白兔注射0. 25mg 免疫原的劑量)的諾氟沙星免疫原免疫溶于0. 5ml 0.9% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl溶液中，直 接進(jìn)行免疫注射。e、七免十天后，頸靜脈取血。血清使用免疫球蛋白A親和層析法進(jìn)行純化。純化 使用密理博公司提供的抗體純化蛋白A試劑盒，產(chǎn)品編號為LSK2ABA20，按照該試劑盒的操 作說明書進(jìn)行操作，獲得抗體。f、抗體效價實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)使用間接競爭酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測定，測定具體方法如下 使用不同的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種抗諾氟沙星多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：ａ）免疫原的制備：以諾氟沙星為半抗原，通過Ｎ－羥基琥珀酰亞胺活性酯法將諾氟沙星與牛血清蛋白偶聯(lián)，得到免疫原；ｂ）多克隆抗體的制備：將免疫原免疫動物，取動物血清，用免疫球蛋白Ａ親和層析法對血清進(jìn)行純化，最后獲得的抗體，即為抗諾氟沙星多克隆抗體。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：崔劍嵐，彭先芝，黃秋鑫，余以義，張坤，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：81[中國|廣州]