【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于外泌體檢測，具體涉及一種利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒及其制備方法。
技術介紹
1、腫瘤是全球范圍內的重大公共衛生問題，危害人類生命健康。近幾十年來，腫瘤的發病率和死亡率逐年攀升，對患者和社會都造成了極為嚴重的負擔。外泌體是指由細胞分泌的小囊泡，通過內吞體途徑形成，直徑約為30-150nm，具有典型的脂質雙分子層結構，包含有原始細胞的許多成分組成，除了dna、rna、氨基酸以及蛋白質外，還包括一些參與細胞間通訊的胞質和細胞表面信號蛋白等。癌細胞的外泌體與腫瘤的發生、轉移、耐藥性有關，在外泌體表面表達的一些蛋白質信息與原發腫瘤密切相關，可以在一定層面上反映腫瘤特有的生物學信息，為腫瘤的精準治療提供有效的信息。癌細胞來源的外泌體，在細胞內運輸產生，在細胞膜和血液中釋放后廣泛分布于機體的體液中，參與細胞之間的通訊、生物體分化發育等相關的生理過程。在體液活檢中，相比于循環腫瘤細胞，外泌體在絕對數量上具有一定的優勢,外泌體可以提供較多數量的生物信息，檢測腫瘤源性的外泌體具有較好的臨床應用前景。研究發現，程序性死亡配體-1(pd-l1)在肺癌等癌細胞來源的外泌體上表達，是一種非常重要的免疫檢查點分子。腫瘤外泌體pd-l1非常有可能成為免疫治療預后的監測標志物，目前所面臨的挑戰是腫瘤來源外泌體pd-l1在人體血液中的濃度含量很低，因此需要開發高靈敏、高穩定性的腫瘤外泌體pd-l1檢測方法，并避免假陽性。
2、近年來，電化學生物傳感器由于具有高靈敏、操作便捷、測量范圍大、儀器輕型方便使
3、核酸序列因為具有可編程和特異識別的特性，在設計模塊用來構筑各種各樣有序結構和裝置中的多種尺寸和多域空間結構，具有良好的應用前景，如硅化的折紙dna，化合物組裝框架核酸，多晶格dna，折紙dna結構，四面體dna結構，納米管dna等。這些創新結構的核酸納米技術在檢測各種蛋白質、mirna或dna等生物標志物方面具有重要科學意義和臨床價值。dna滾環擴增(rca)技術是在等溫條件下對dna信號的一種放大方法，將實驗生成的dna擴增產物固著到具有固體性質的支持物上，比如納米材料表面、載玻片、微孔等，rca結合納米材料的信號放大技術在保持立體分析功能性的同時，還能提高科學研究和分析的靈敏度和特異性，可用于極低含量生物大分子和生物標記物的檢測和分析研究。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種利用電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒。該試劑盒具有優異的化學生物相容性、同軸空間效應和生物穩定性、靈敏度高、特異選擇性好，普適于多種腫瘤外泌體pd-l1的快速識別檢測。
2、本專利技術涉及一種基于化學生物同軸材料(chemical?biological?coaxialmaterials，cbcms)化學生物傳感檢測腫瘤外泌體pd-l1的技術，以肺癌為例，其他癌癥的檢測，可選取其他癌癥標志蛋白進行替換。脫氧核糖核酸(簡稱dna)循環放大技術，具體地說是利用核酸序列可以特異性識別靶標的性能，并且在特異性識別外泌體pd-l1后，發生dna滾環復制放大反應，基于柱狀支架的生物同軸材料可有序動態自組裝核酸結構，在電極上原位生成具有獨特結構的cbcms，實現了對信號分子的聚集放大。
3、為實現上述技術目的，本專利技術所采用的技術方案為：
4、一種利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒，試劑盒包括電極、ito/pt同軸納米材料和功能核酸序列。
5、進一步的，所述功能核酸序列為pd-l1核酸序列、egfr核酸序列或者cd63核酸序列中的一種。
6、一種利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
7、(1)ito/pt同軸納米材料的制備方法：將3.815g?pvp，0.221g?sncl4·5h2o和1.0gin(no3)3溶解在18-25g的dmf中，在室溫下磁力攪拌18-20小時，變成均勻透明dmf溶膠；將3.815gpvp和0.912g?k2ptcl6溶解在18-25g的dmf中，在室溫下磁力攪拌18-20小時，得到均勻澄清的dmf溶膠，將兩種溶膠分別轉移到兩支5ml的透明注射器里，在提前安裝調試好的靜電紡絲機上組合裝配不銹鋼材質的雙驅動直列式的針頭，將兩支5ml注射器放置到電驅動智能化注射泵中，然后將雙驅動直列式針頭連接到靜電紡絲金屬電極上，接收裝置由錫紙和接地鐵板組成，接地鐵板與雙驅動直列式針頭之間的距離固定調整為180mm，設置靜電紡絲的流動速度10μl/min，靜電紡絲的電壓為17kv(dmf溶膠)。紡絲8-10小時，停止電動智能注射泵，將錫箔與靜電紡絲材料一起取出，放入65℃的烘箱干燥16-18小時，取出紡絲物質再轉入馬弗爐中，以3℃/min速度升溫至900℃，將混合物煅燒120分鐘后自然冷卻至室溫取出，經過機械研磨后得到ito/pt同軸納米材料；
8、(2)鏈霉生物素sa修飾ito/pt同軸納米材料的組裝合成：在1.5ml、2mm巰基乙酸(ta)水溶液中均勻分散步驟(1)所得3mg?ito/pt同軸納米材料，得到的混合物溶液需用超聲設備處理15-16小時之后再用水反復洗滌，制備獲得羧基化的ito/pt同軸納米材料(ito/pt-ta)；將羧基化的ito/pt同軸納米材料與sa按照1：(3-6)的質量比分散在10mmpbs緩沖溶液中，在37℃振蕩器內反應2小時，用超純水反復清洗和離心3次，制備得到ito/pt-sa同軸納米材料；
9、(3)化學生物傳感器的制備：將工作電極用氧化鋁粉末拋光3次，水和乙醇全面沖洗3次，使用超聲設備處理用以除去過量的氧化鋁，在氮氣下干燥；將工作電極置于0.01mkcl和0.05m?h2so4的混合溶液中做氧化還原循環操作，激活電極用于后期電極修飾；在室溫下，將10μltcep和h1序列的混合溶液滴加在工作電極表面17-20小時，tcep用于激活dna序列中的巰基，破壞dna序列中的二硫鍵，在au工作電極上形成au-s鍵，并將dna序列探針修飾在au電極表面，然后用pbst洗滌電極3次，除去非特異性吸附的dna序列，再將修飾的工作電極浸入1mm?mch中70分鐘以封閉表面，然后用pbst沖洗工作電極表面，并在修飾電極表面滴涂10μl、5μm功能核酸序列，在保持37℃下與dna探針雜交反應200分鐘，用pbst再次沖洗修飾電極3次，得到三種核酸序列修飾三個電極，即可作為本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體PD-L1的試劑盒，其特征在于，試劑盒包括電極、ITO/Pt同軸納米材料和功能核酸序列。
2.根據權利要求1所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體PD-L1的試劑盒，其特征在于，所述功能核酸序列為PD-L1核酸序列、EGFR核酸序列或者CD63核酸序列中的一種。
3.一種權利要求1或2所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體PD-L1的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體PD-L1的試劑盒的制備方法，其特征在于，靜電紡絲的接收裝置由錫紙和接地鐵板組成，接地鐵板與雙驅動直列式針頭之間的距離固定調整為180mm；靜電紡絲方法為：設置靜電紡絲的流動速度10μL/min，靜電紡絲的電壓為17kV；紡絲時間8-10小時，停止電動智能注射泵，將錫箔與靜電紡絲材料一起取出，放入65℃的烘箱干燥16-18小時，取出紡絲物質再轉入馬弗爐中，以3℃/min速度升溫至900℃，將混合物煅燒120分鐘后自然冷卻至室溫
5.根據權利要求3所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體PD-L1的試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(2)中羧基化的ITO/Pt同軸納米材料ITO/Pt-TA和SA與PBS緩沖溶液的的固液質量比為1：(10-20)。
6.根據權利要求3所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體PD-L1的試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟(2)PBS緩沖溶液內含有10mM?EDC。
...【技術特征摘要】
1.一種利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒，其特征在于，試劑盒包括電極、ito/pt同軸納米材料和功能核酸序列。
2.根據權利要求1所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒，其特征在于，所述功能核酸序列為pd-l1核酸序列、egfr核酸序列或者cd63核酸序列中的一種。
3.一種權利要求1或2所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述利用基于同軸雙路徑的電化學傳感器檢測腫瘤外泌體pd-l1的試劑盒的制備方法，其特征在于，靜電紡絲的接收裝置由錫紙和接地鐵板組成，接地鐵板與雙驅動直列式針頭之間的距離固定調整為180mm；靜電紡絲方法為：設置靜電紡絲...
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