【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于腫瘤生物制品領域，涉及過繼免疫治療中的分泌pd1和ctla4雙單域抗體的egfrvⅲcar-t細胞(egfrvⅲ/pd1/ctla4?nb?car-t細胞)及其制備方法和應用。
技術介紹
1、t細胞可以通過表達car靶向腫瘤細胞。嵌合抗原受體(chimeric?antigenreceptor,car)通過將可以特異性識別腫瘤抗原的單鏈抗體與可活化t細胞的受體胞內結構域“免疫受體酪氨酸活化基序”用人工方法融合成重組基因來制備。car-t細胞療法是目前腫瘤免疫治療的當下最熱門最有研究價值的治療方法。目前car-t治療在血液腫瘤中取得了很好的進展，但是由于實體腫瘤微環境復雜，car-t對實體瘤的殺傷效果有限，因此需要探索新的方法來提高car-t治療實體腫瘤的活性。
2、car的基礎設計中包括腫瘤相關抗原結合區、胞內信號區、跨膜區、胞外鉸鏈區等。car-t目前已經發展到第四代，在血液腫瘤中取得了很好的進展，而對于實體瘤治療，car-t細胞療法的效果一直不佳，其中重要原因是腫瘤特異性t細胞難以突破腫瘤微環境的免疫抑制作用。除此之外目前大多數car識別抗原的部分是由單鏈抗體組成的,由于不同的單鏈抗體的vl和vh之間會出現錯配，使得表達出來單鏈抗體親和力下降，也是造成car-t治療效果不佳的原因。因此需要探索新的方法來提高car-t治療實體腫瘤的活性。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種工程化基于單域抗體靶向egfrvⅲ且分泌pd1單域抗體和ctla4單域抗體
2、于是，本專利技術在第一方面提供了一種分泌pd1和ctla4雙單域抗體的egfrvⅲcar-t細胞，所述car-t細胞表達嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括胞外抗原識別區egfrvⅲ單域抗體序列、鉸鏈區cd8和跨膜區cd8串聯序列、胞內共刺激域cd137序列、胞內信號轉導域cd3ζ序列、pd1單域抗體序列和ctla4單域抗體序列，并且能夠將pd1單域抗體和ctla4單域抗體到細胞外。
3、本專利技術在第二方面提供了一種制備本專利技術第一方面所述的car-t細胞的方法，所述方法包括以下步驟：
4、(1)獲取編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；
5、(2)將所述核苷酸序列克隆到慢病毒載體中并在大腸桿菌中表達，獲得包括所述核苷酸序列的重組慢病毒載體；
6、(3)使用所述重組慢病毒載體通過轉染293t細胞來對慢病毒進行包裝，獲得包裝慢病毒；
7、(4)將所述包裝慢病毒與t細胞共培養，獲得表達所述嵌合抗原受體并能將pd1單域抗體分泌到細胞外的car-t細胞。
8、本專利技術在第三方面提供了一種根據本專利技術第一方面所述的car-t細胞在制備治療腫瘤制劑中的應用。
9、優選的是，所述腫瘤為egfrvⅲ陽性腫瘤。
10、本專利技術在第四方面提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據本專利技術第一方面所述的car-t細胞或根據本專利技術第二方面所述方法制備的car-t細胞和藥學上可接受的載體。
11、本專利技術在第五方面提供了一種編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列編碼根據本專利技術第一方面所述的car-t細胞或根據本專利技術第二方面所述方法制備的car-t細胞表達的所述嵌合抗原受體。
12、本專利技術在第六方面提供了一種嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體為根據本專利技術第一方面所述的car-t細胞或根據本專利技術第二方面所述方法制備的car-t細胞所表達的所述嵌合抗原受體。
13、本專利技術人經過研究發現，在對egfrvⅲ陽性腫瘤免疫治療中，靶向egfrvⅲ且分泌pd1單域抗體和ctla4單域抗體的car-t細胞能夠帶來相對于現有技術而言具有顯著優勢的技術效果：增強特異性的靶向，即增強免疫細胞靶向識別腫瘤抗原，減少對正常組織的毒副作用；所述car-t細胞(有時稱為egfrvⅲ/pd1/ctla4?nb?car-t細胞)所擁有的這些特性主要源于本專利技術所設計的嵌合抗原受體的功能結構，該結構包括抗原識別區域和細胞內激活區域，而細胞內激活區域能延長細胞在體內的存活時間；另外，本專利技術采用慢病毒感染進行制備car-t細胞，提供一種高效制備egfrvⅲ/pd1/ctla4?nb?car-t細胞的方法，該方法制備的car-t細胞能穩定表達嵌合抗原受體，具有較好的應用前景。
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1.一種分泌PD1和CTLA4雙單域抗體的EGFRvⅢCAR-T細胞，其特征在于，所述CAR-T細胞表達嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括胞外抗原識別區EGFRvⅢ單域抗體序列、鉸鏈區CD8和跨膜區CD8串聯序列、胞內共刺激域CD137序列、胞內信號轉導域CD3ζ序列、PD1單域抗體序列和CTLA4單域抗體序列，并且能夠將PD1單域抗體和CTLA4單域抗體到細胞外。
2.根據權利要求1所述的CAR-T細胞，其特征在于：
3.根據權利要求1或2所述的CAR-T細胞，其特征在于：
4.根據權利要求1至3中任一項所述的CAR-T細胞，其特征在于：
5.一種制備權利要求1至4中任一項所述的CAR-T細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：
7.一種根據權利要求1至4中任一項所述的CAR-T細胞或根據權利要求5或6所述方法制備的CAR-T細胞在制備治療腫瘤制劑中的應用；優選的是，所述腫瘤為EGFRvⅢ陽性腫瘤。
8.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據權利
9.一種編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列，其特征在于：
10.一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為根據權利要求1至4中任一項所述的CAR-T細胞或根據權利要求5或6所述方法制備的CAR-T細胞所表達的所述嵌合抗原受體。
...【技術特征摘要】
1.一種分泌pd1和ctla4雙單域抗體的egfrvⅲcar-t細胞，其特征在于，所述car-t細胞表達嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括胞外抗原識別區egfrvⅲ單域抗體序列、鉸鏈區cd8和跨膜區cd8串聯序列、胞內共刺激域cd137序列、胞內信號轉導域cd3ζ序列、pd1單域抗體序列和ctla4單域抗體序列，并且能夠將pd1單域抗體和ctla4單域抗體到細胞外。
2.根據權利要求1所述的car-t細胞，其特征在于：
3.根據權利要求1或2所述的car-t細胞，其特征在于：
4.根據權利要求1至3中任一項所述的car-t細胞，其特征在于：
5.一種制備權利要求1至4中任一項所述的car-t細胞的方法，其特征在于，所述方法...
【專利技術屬性】
技術研發人員：盧小玲，楊曉梅，李海霞，尹時華，姜曉兵，
申請(專利權)人：廣西醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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