【技術實現步驟摘要】
本專利技術登革熱病毒檢測領域，特別涉及一種針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒及應用。
技術介紹
1、登革熱病毒(denv)是黃病毒科黃病毒屬蚊媒病原體，該病毒主要在其載體埃及伊蚊和白紋伊蚊存在的熱帶地區的城市或半城市地區傳播，估計每年感染3.9億人，其中約1億人表現出臨床癥狀。登革熱病毒(dengue?virus)有四種主要的血清型，分別是den-1、den-2、den-3和den-4，這四種血清型是屬于同一種病毒，但是在人體內表現為不同的免疫反應。人感染一種血清型的登革熱病毒后，會產生對該血清型的免疫保護，但對其他血清型的登革熱病毒可能沒有足夠的免疫力，多次感染不同血清型的登革熱病毒可能增加患嚴重登革熱的風險，因為交叉反應的免疫反應可能引發更嚴重的疾病。
2、從歷史上看，denv的分子系統發育研究依賴于包膜(e)基因(～1.5kbp)的測序，該基因編碼病毒的主要表面抗原，但是如果為了獲取更好的系統發育分辨率就需要獲得更長的序列，例如病毒的完整(～10.2kbp)編碼區，目前的現有技術的實現方法無法很好地全面覆蓋檢測登革熱病毒全基因組。
3、實現這一目標的現有方法包括在單管反應中擴增5個長(1-2.5kbp)擴增子的血清型特異性pcr擴增，然后進行凝膠電泳進行條帶純化，并在sanger毛細管或illumina平臺上測序。在該方法中，在測序前對denv基因組進行pcr擴增有助于提高該方法的靈敏度，便于從低病毒載量的臨床樣本中恢復序列數據，但是值得注意的是，由于引物與病毒基因組之間的不一致，pcr擴
4、另一種宏基因組學的方法是對樣本中存在的所有核酸進行測序，而不使用靶向pcr步驟。從理論上講，該方法的確可以檢測任何感染病毒的序列數據，不論血清型或毒株都無需先驗鑒定。然而這種方法也有缺點，其對待測病毒的敏感性低，因為與宿主相比，病毒遺傳物質通常含量較少，特別是當病毒載量低時則含有的病毒遺傳物質就更少。因此，宏基因組測序的靈敏度較差，需要減少可同時測序的樣品數量，這大大增加了成本。
5、第三種denv分離檢測方法是基于生物素磁珠結合的寡核苷酸探針雜交捕獲，這些探針用于特異性結合和分離病毒核酸，因此受到其與病毒基因組退火能力的限制，且該方法因核酸回收效率低，具有反應時間長、修飾探針成本高的缺點。
6、綜上所述，目前市面上針對于登革熱病毒的分型檢測僅能測定1-2種血清型，且具有對樣本的要求較高或者反應條件要求高的問題。
技術實現思路
1、本方案提供了一種的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒及應用，能從血液、咽拭子、感染組織環境中提取的核酸樣本中進行登革熱病毒全基因組的反轉錄與富集擴增，可以用于檢測與鑒定登革熱病毒，也可為登革熱病毒的進化分析、分子流行病學研究及科學防控提供了有力的技術手段。
2、本方案提供的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒不僅可用于登革熱病毒全基因組的擴增與測序，而且還可用于登革熱病毒全基因組的快速檢測與鑒定，不僅適用于近幾年流行毒株，而且還適用于回溯性隊列研究，具有操作簡便、特異性強、靈敏度高和準確性好的優點，同時也為登革熱病4種血清型的進化分析、分子流行病學研究及科學防控提供了有力的技術手段。
3、為實現以上專利技術目的，本方案提供了一種針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，包括：兩組引物池，其中第一引物池內的引物含有引物序列如seq?id?no.1-seq?id?no.22所示的靶向引物；第二引物池內的引物含有引物序列如seq?id?no?23-seqid?no.41所示的靶向引物。
4、具體的，第一引物池內的靶向引物的引物序列如下表一所示：
5、表一第一引物池的靶向引物
6、
7、
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9、其中第一引物池中的seq?id?no.1-seq?id?no.44所示的靶向引物中相鄰序號的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序兩兩組成一個引物對，seq?id?no.1，seq?idno.3，seq?id?no.5，seq?id?no.7，seq?id?no.9，seq?id?no.11，seq?id?no.13，seq?idno.15，seq?id?no.17，seq?id?no.19，seq?id?no.21，no.23，seq?id?no.25，seq?id?no.27，seq?id?no.29，seq?id?no.31，seq?id?no.33，seq?id?no.35，seq?id?no.37，seq?idno.39，seq?id?no.41和seq?id?no.43對應的是正向的靶向引物，seq?id?no.2，seq?idno.4，seq?id?no.6，seq?id?no.8，seq?id?no.10，seq?id?no.12，seq?id?no.14，seq?idno.16，seq?id?no.18，seq?id?no.20，seq?id?no.22，seq?id?no.24，seq?id?no.26，seq?idno.28，seq?id?no.30，seq?id?no.32，seq?id?no.34，seq?id?no.36，seq?id?no.38，seq?idno.40，seq?id?no.42和seq?id?no.44對應的是反向的靶向引物。
10、具體的，第二引物池內的的靶向引物的引物序列如下表二所示：
11、表二第二引物池的靶向引物
12、
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15、其中第二引物池中的seq?id?no.45-seq?id?no.89所示的靶向引物中相鄰序號的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序組成一個引物對，seq?id?no.45，seq?id?no.47，seq?id?no.49，seq?id?no.51，seq?id?no.53，seq?id?no.55，seq?id?no.56，seq?idno.58，seq?id?no,60，seq?id?no.62，seq?id?no.64，seq?id?no.66，seq?id?no.68，seq?idno.70，seq?id?no.72，seq?id?no.74，seq?id?no.76，seq?id?no.78，seq?id?no.80，seq?idno.82，seq?id?no.84，seq?id?no.86和seq?id?no.88對應的是正向的靶向引物，seq?idno.46，seq?id?no.48，seq?id?no.50，seq?id?no.52，seq?id?no.54，seq?id?no.57，seq?idno本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，兩組引物池中的每一引物由如SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.41其中的靶向引物、UMI序列和barcdoe序列排列組成。
3.根據權利要求1所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，第一引物池中的SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.44所示的靶向引物中相鄰序號的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序兩兩組成一個引物對，第二引物池中的SEQ?ID?NO.45-SEQID?NO.89所示的靶向引物中相鄰序號的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序組成一個引物對。
4.根據權利要求1所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，兩組引物池內的引物分別對登革熱病毒進行多重PCR擴增，且兩組引物池的多重PCR擴增條件相同。
5.根據權利要求4所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，多重PCR擴增條件如下表所示：<...
【技術特征摘要】
1.一種針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，兩組引物池中的每一引物由如seq?id?no.1-seq?id?no.41其中的靶向引物、umi序列和barcdoe序列排列組成。
3.根據權利要求1所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，第一引物池中的seq?id?no.1-seq?id?no.44所示的靶向引物中相鄰序號的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序兩兩組成一個引物對，第二引物池中的seq?id?no.45-seqid?no.89所示的靶向引物中相鄰序號的正向的靶向引物和反向的靶向引物依次序組成一個引物對。
4.根據權利要求1所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，兩組引物池內的引物分別對登革熱病毒進行多重pcr擴增，且兩組引物池的多重pcr擴增條件相同。
5.根據權利要求4所述的針對4種血清型登革熱病毒的全基因組捕獲試劑盒，其特征在于，多重pcr擴增條件如下表所示：
6.一種針對4種血清型登...
【專利技術屬性】
技術研發人員：倪敏君，毛凌峰，馬思杰，胡群，王敏，吳斯豪，龍再浩，劉永磊，
申請(專利權)人：杭州柏熠科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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