【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉遺傳學(xué)和植物育種領(lǐng)域，具體為一種篩選水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的分子標(biāo)記、擴(kuò)增或檢測(cè)分子標(biāo)記的引物以及檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
1、水稻(oryza?sativa)是世界上最重要的谷類作物之一，是世界上一半以上的人口的糧食來(lái)源。為減少勞動(dòng)力和資源成本，水稻直播特別是機(jī)械化直播在亞洲已被廣泛采用(farooq?et?al.，2011；zhou?et?al.，2019)。幼苗從深層土壤中均勻出苗后形成的能力，稱為出苗活力，使品種適合直播。然而，大多數(shù)現(xiàn)代水稻品種在直播后出苗活力較差，這導(dǎo)致種子使用量和資源成本增加(mahender?et?al.，2015)。
2、對(duì)于水稻(oryza?sativa)來(lái)說(shuō)，胚芽鞘是幼苗的一個(gè)基本結(jié)構(gòu)，它在幼苗穿過(guò)土層時(shí)保護(hù)幼苗。位于胚芽鞘下面的中胚軸，在黑暗中發(fā)育，它把胚芽鞘的基部推向土壤表面。中胚軸和胚芽鞘的伸長(zhǎng)受各種遺傳和環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，這些因素刺激水稻幼苗的出苗(takahashi,1978；helms?et?al.，1989；dilday?et?al.，1990)。
3、中胚軸是把水稻幼苗的子葉和胚芽鞘分開(kāi)的結(jié)構(gòu)，中胚軸較長(zhǎng)的品種出苗活力增加，使直播變得可行(詹等，2020)。野生稻和許多古老的地方品種在深層土壤或黑暗中發(fā)芽時(shí)具有長(zhǎng)中胚軸表型。然而，大多數(shù)現(xiàn)代品種中胚軸較短(doebley?et?al.，2006)。
4、目前雖然已經(jīng)檢測(cè)到許多控制水稻中胚軸伸長(zhǎng)的qtl，但只有少數(shù)位點(diǎn)被精細(xì)定位和克隆。水稻gsk2是一種參與油菜素類固醇信號(hào)傳
5、中胚軸較短的水稻出苗率低，需要與其他中胚軸較長(zhǎng)的水稻雜交，再通過(guò)回交或自交，在后代中選擇獲得中胚軸較長(zhǎng)的品種。過(guò)去在判斷水稻中胚軸長(zhǎng)度的品種時(shí)，育種者主要通過(guò)逐一測(cè)量不同水稻的中胚軸的長(zhǎng)度來(lái)判斷該品種是否是中胚軸較長(zhǎng)的品種。但該方法費(fèi)時(shí)且費(fèi)力。隨著各種分子標(biāo)記的發(fā)展，許多重要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的分子標(biāo)記被開(kāi)發(fā)用于水稻育種。
6、因此，需要提供一種分子標(biāo)記、相應(yīng)的引物和檢測(cè)方法來(lái)輔助培育和篩選具有對(duì)應(yīng)相對(duì)較長(zhǎng)中胚軸長(zhǎng)度的品種，從而增加水稻的產(chǎn)量，顯得十分重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)旨在提供一種篩選水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的分子標(biāo)記gsk2(taql-v2)及應(yīng)用。
2、本專利技術(shù)還提供了檢測(cè)該分子標(biāo)記的引物及方法，能夠快速并準(zhǔn)確地鑒定gsk2的不同等位基因型，可用來(lái)輔助培育篩選具有較長(zhǎng)中胚軸長(zhǎng)度的水稻。
3、本專利技術(shù)技術(shù)方案為，gsk2基因在控制水稻中胚軸長(zhǎng)度方面的應(yīng)用。尤其是第3319位堿基的g/a多態(tài)性可用于控制水稻中胚軸長(zhǎng)度。
4、水稻gsk2主要分兩種基因型：gsk23319g基因型和gsk23319a基因型；在編碼區(qū)3319bp位置處存在g/a的多態(tài)性。
5、對(duì)自然群體水稻gsk2基因序列分析發(fā)現(xiàn)，水稻gsk2基因單倍型主要分a型和b型兩種，a單倍型gsk2和b單倍型gsk2在編碼區(qū)3319bp位置處存在g/a的多態(tài)性(sun?et?al.2018年)。因此，gsk23319g可以代表a單倍型gsk2，gsk23319a可以代表b單倍型gsk2。
6、gsk23319a基因型水稻具有相對(duì)較長(zhǎng)的中胚軸長(zhǎng)度，編碼區(qū)3317bp-3320bp處為tcaa；gsk23319g基因型水稻具有相對(duì)較短的中胚軸長(zhǎng)度，編碼區(qū)3317bp-3320bp處為tcga。
7、本專利技術(shù)的另一個(gè)技術(shù)方案為，一種控制水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2的分子標(biāo)記(以下簡(jiǎn)稱gsk2(taql-v2))，gsk23319g基因型水稻中，gsk2編碼區(qū)3317bp-3320bp處為tcga；gsk23319a基因型水稻中，gsk2基因編碼區(qū)3317bp-3320bp處為tcaa。
8、分子標(biāo)記gsk2(taql-v2)位于中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2編碼區(qū)3317bp-3320bp處。在gsk23319g基因型水稻中，該位點(diǎn)的4個(gè)核苷酸序列“tcga”能夠被限制性核酸內(nèi)切酶taql-v2識(shí)別并剪切，而gsk23319a基因型水稻，gsk2基因編碼區(qū)該位點(diǎn)的4個(gè)核苷酸序列“tcaa”，不能被限制性核酸內(nèi)切酶taql-v2識(shí)別并剪切，由此可以快速和準(zhǔn)確地區(qū)分中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2兩種不同基因型。
9、一種檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度的基因gsk2等位基因的引物，其核苷酸序列包括gsk2-f和gsk2-r。更優(yōu)選的，其核苷酸序列如gsk2-f和gsk2-r所示。
10、seq?id?no.1(gsk2-f)：5’-gggtggagtggagaaaca-3’
11、seq?id?no.2(gsk2-r)：5’-tcaccttcatgtgaacttc-3’
12、這種引物可以用于擴(kuò)增和檢測(cè)上述新的分子標(biāo)記gsk2(taql-v2)或者擴(kuò)增和檢測(cè)水稻中胚軸基因gsk2。
13、一種鑒定水稻中胚軸長(zhǎng)度的方法，檢測(cè)純合子水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的第3319位堿基的g/a多態(tài)性，gsk23319a基因型水稻具有較長(zhǎng)的中胚軸長(zhǎng)度，gsk23319g基因型水稻的中胚軸較短。
14、檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的方法，包括如下步驟：
15、(1)提取水稻基因組dna作為模板(可采用ctab法)，加入上述2種引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
16、(2)pcr產(chǎn)物用taql-v2進(jìn)行酶切反應(yīng)；
17、(3)取酶切產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)。
18、72℃優(yōu)選的，步驟(1)中，pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?3～95℃預(yù)變性4～7min；93～95℃變性42～50s、51～54℃退火42～50s、70～73℃延伸25～35s，共30～35個(gè)循環(huán)；最后70～73℃延伸9～12min。更優(yōu)選的，pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、55℃退火30s、延伸45s，共36個(gè)循環(huán)；最后延伸5min。
19、優(yōu)選的，步驟(3)中，在2.5～3.5％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)；更優(yōu)選用3％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。
20、測(cè)結(jié)果顯示，含有g(shù)sk23319g對(duì)應(yīng)相對(duì)較短中胚軸長(zhǎng)度水稻均含有分子量分別約為537bp和117bp的兩條帶，而含有g(shù)sk23319a中對(duì)應(yīng)相對(duì)較長(zhǎng)中胚軸長(zhǎng)度的水稻含有分子量約為654bp的條帶。上述方法可用于篩選鑒定分別含有g(shù)sk23319g的基因型水稻與含有g(shù)sk23319a的基因型水稻雜交后代，以及分別含有g(shù)sk23319g的基因型水稻與含有g(shù)sk23319a、的基因型水稻自交后代，或者分別含有g(shù)sk23319g的基因型水稻與含有g(shù)sk23319a的基因型水稻回交的后代。所檢測(cè)的水稻為含有g(shù)sk23319g的基因型水稻、含有g(shù)sk23319a的基因型水稻、含有g(shù)sk23319g的基因型水稻與含有g(shù)sk23319a的基因型水稻的本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.GSK2基因在控制水稻中胚軸長(zhǎng)度方面的應(yīng)用。
2.一種控制水稻中胚軸長(zhǎng)度基因GSK2等位基因的分子標(biāo)記，其特征在于，在具有相對(duì)較短中胚軸長(zhǎng)度的水稻中，GSK2基因編碼區(qū)3317bp-3320bp序列為TCGA；在具有相對(duì)較長(zhǎng)中胚軸長(zhǎng)度的水稻中，GSK2基因編碼區(qū)3317bp-3320bp序列為TCAA。
3.一種檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度的基因GSK2等位基因的引物，其特征在于，上下游引物分別含有SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度基因GSK2等位基因的引物，其特征在于，上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。
5.一種鑒定水稻中胚軸長(zhǎng)度的方法，其特征在于，檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度基因GSK2等位基因的第3319位堿基的G/A多態(tài)性，A基因型水稻具有較長(zhǎng)的中胚軸長(zhǎng)度，G基因型水稻的中胚軸較短。
6.檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度基因GSK2等位基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s、55℃退火30s、延伸45s，共36個(gè)循環(huán)；最后延伸5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的凝膠為2.5～3.5％瓊脂糖凝膠。
10.權(quán)利要求2所述的水稻中胚軸長(zhǎng)度基因GSK2等位基因的分子標(biāo)記、權(quán)利要求3或4所述的引物或者權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的方法在培育或篩選中胚軸較長(zhǎng)的水稻方面的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.gsk2基因在控制水稻中胚軸長(zhǎng)度方面的應(yīng)用。
2.一種控制水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的分子標(biāo)記，其特征在于，在具有相對(duì)較短中胚軸長(zhǎng)度的水稻中，gsk2基因編碼區(qū)3317bp-3320bp序列為tcga；在具有相對(duì)較長(zhǎng)中胚軸長(zhǎng)度的水稻中，gsk2基因編碼區(qū)3317bp-3320bp序列為tcaa。
3.一種檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度的基因gsk2等位基因的引物，其特征在于，上下游引物分別含有seq?id?no.1和seq?id?no.2的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的引物，其特征在于，上下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。
5.一種鑒定水稻中胚軸長(zhǎng)度的方法，其特征在于，檢測(cè)水稻中胚軸長(zhǎng)度基因gsk2等位基因的第3319位堿基的g/a多態(tài)性，a基因型水稻具有較長(zhǎng)的中胚軸長(zhǎng)度，g基因型水稻的中胚軸較...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陶菊紅，趙國(guó)超，朱孟君，季向東，張濤，宗士鵬，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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