生物反應器組織工程活性人工皮膚產業化生產含有活化素Ａ的無血清培養液及其配制方法技術

本發明專利技術屬于生物醫學領域，涉及生物反應器、細胞組織工程、活性人工皮膚大規模生產的培養液。本發明專利技術提供了一種用于大規模組織工程生產活性人工皮膚的培養液及其具體配制方法，該培養液含有如下組分：細胞生長因子３－３０ｎｇ／ｍＬ、胰島素２－３０μｇ／ｍＬ、氫化可的松０．２－０．６μｇ／ｍＬ、垂體提取物３－３０μｇ／ｍＬ、鈣離子０．５－５．５ｍｍｏｌ／Ｌ、轉鐵蛋白３－３０μｇ／ｍＬ、青霉素２０－６０Ｕ／ｍＬ、鏈霉素２０－６０ｍｇ／ｍＬ、活化素Ａ?０．１－０．９ｎｇ／ｍＬ。本方法提供的培養液適合于大規模配制，性能穩定，保質期長，便于產品的大規模合成及規模化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫學組織工程領域，特別是涉及生物反應器、細胞組織工程、活性人工皮膚大規模產業化生產含有活化素A的無血清培養液。
技術介紹
皮膚是人體最大的組織器官，也是人體最重要的器官之一，它主要有三部分組成， 即最外面的表皮層，中間的真皮層和最下面的皮下組織構成。表皮層和真皮層之間含有基 底膜，皮膚組織工程經歷了從表皮替代物、真皮替代物到具有雙層結構的復合組織工程皮 膚的階段，有關基礎研究及應用研究有了很大的進展，但如何能夠大規模地產業化地體外 生產組織工程皮膚，一直是一個挑戰，難題至今沒能解決。阻礙了組織工程皮膚的臨床應用 及產業化。目前，市場上還沒有應用于生物反應器大規模產業化生產組織工程活性皮膚的培 養液。目前現有的實驗室用于組織工程皮膚研究的培養液在試劑的穩定性、細胞培養效果 及細胞培養的時間等方面存在明顯的不足。而且配制過程使用過程操作繁瑣復雜，不能用 于大規模皮膚細胞的培養，經檢索，具有高穩定性，操作簡單，能夠用于生物反應器大規模 及產業化生產組織工程活性人工皮膚的培養液至今還沒有見到公開資料。雖然目前有各種細胞培養液，但這些培養液一是成本高，二是不能用于大規模地 產業化地生產和培養。含有活化素A的本培養液及其配制方法目前沒有報道。生物組織工程學是應用生命科學和組織工程學的原理與方法，研究發展用于修 復、增進或改善人體各種組織或器官損傷后功能和形態的一門新興學科。是繼細胞生物學 和分子生物學之后，生命科學發展史上又一個新的里程碑。生物組織工程的核心，是建立由 細胞和生物材料構成的三維空間復合體，其具體方法是將體外培養的高濃度的與功能相關 的活細胞種植于細胞外基質上(ECM)，然后移植到動物體內達到新的有功能的組織目的。與 傳統的方法相比較，其最大的優點在于(1)形成具有生命力的活體組織，對損傷或病損組 織進行形態、結構和功能的重建并達到永久性替代；(2)可以用較少量的組織細胞(種子細 胞)經體外培養擴增后，來修復大塊的組織缺損；(3)可按組織、器官缺損情況任意塑形，達 到完美的形態修復。將組織工程學應用于人工皮膚的研發和生產，將會帶來極大的社會效益和經濟效 益。據WHO統計，中國每年約有九百萬燒燙傷病人的搶救治療是目前臨床上一大挑戰，特別 是目前經濟處于快速發展和轉型時期，工傷和意外事故頻繁發生，常常導致人體大面積燒 燙傷的發生。由于大面積深度燒燙傷，過多的全層皮膚毀壞，而導致屏障功能喪失及及免疫 調節失衡，產生感染，水電解質系亂等造成病人因膿毒癥和臟器功能衰竭而死亡。因此，早 期創面覆蓋和皮膚移植以減輕脫水和預防感染是目前臨床上搶救治療大面積燒燙傷病人 的主要措施。對于大面積燒燙傷病人，由于自體健康皮膚有限，臨床上最初采用豬皮或異體 人類皮膚作為移植材料。但是免疫排斥反應使得移植皮膚難以成活。由此可見，燒燙傷病人皮膚移植所面臨的挑戰是皮源的緊張和免疫排斥反應。自體皮源不足是大面積燒燙傷病人救治過程中的難題。盡早在功能和外觀上修復 創面對降低大面積燒燙傷病人的死亡率，提高生存質量和重返社會極為重要。因此，盡快地 突破組織工程人工皮膚大規模研發和生產的瓶頸，是關系到整個人類社會和經濟發展的大 事情。該培養液的問世，從技術上解決了人工皮膚大規模化生產的難題，將極大地推動活性 人工皮膚的發展。目前已研制出各種不同功能的人工皮膚替代品，部分已經商品化并應用 于臨床。皮膚由表皮，真皮和皮下組織組成，是人體最大的組織器官，也是人體最重要的器 官之一，它最重要的功能是屏障功能，保護人體免受外界的傷害，同時具有溫度調節，感覺， 防止紫外線輻射等其他重要的功能。燒燙傷是一種常見的創傷，特別是大面積燒燙傷，如果 得不到及時的救治，病人將會發生體液流失，外來菌體入侵，因感染而死亡，而目前燒燙傷 還沒有有效的治療方法。燒燙傷最主要的治療手段就是皮膚移植，而大面積燒燙傷病人缺 乏自己可利用的皮膚，沒有足夠的皮膚覆蓋，將會危及病人的生命及引起一系列的并發癥。 組織工程人工培養皮膚是一門具有非常廣闊市場前景的學科，它解決了燒燙傷病 人自體皮源不足的難題，但是沒有很好的皮膚細胞培養液，限制組織工程皮膚的發展，現有 的皮膚細胞培養液，不能進行大規模地組織工程皮膚生產及培養，往往僅限于實驗室小規 模地培養，且細胞培養的周期長，成本大，耗材高，細胞的傳代能力也很短暫，而本專利技術解決 了上述問題，是第一次公開了這種培養液可以用于大規模地組織工程皮膚培養及生產，該 培養液也可以應用于生物器技術進行大規模地生產和培養。本專利技術的培養液配方解決了組 織工程皮膚大規模生產的瓶頸問題，培養液配方在本領域是空白，經檢索，尚未發現用于皮 膚產業化生產的含有活化素A的這種培養液的配方。本專利技術的培養液可用于生物反應器， 進行皮膚細胞培養，能進行大規模地產業化生產，降低生產成本。同時也可用于無血清培 養，這樣生產出來的產品更加安全，同時也降低了生產成本，配制的培養液保存期更長，可 以長期保存，能夠大規模地生產和配制。本專利技術還第一次公開了將活化素A用于人類皮膚細胞培養液，經檢索，沒有任何 人將活化素A加入培養液當中，因此具有很強的創新性。活化素A又稱為激活素A、轉化生長因子A，是在兩棲動物胚胎中發現的中胚層誘 導因子，其生理功能相當廣泛，包括中胚層誘導，血管再生，細胞分化等(參見附后的相關 參考文獻)。現有培養液的缺點一是現配現用，時效性很差。二是含有小牛血清，成本高，風險 大，容易導致疾病的傳播，比如瘋牛病等。三是不包括我們培養液的特有物質，因此皮膚細 胞非常容易分化，細胞生長緩慢。四是培養液本身不能進行大規模地產業化配制。五是現 有的培養液不能應用于生物反應器技術。六是不能大規模地進行組織工程皮膚的產業化生 產，這是制約組織工程皮膚產業化的瓶頸。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種穩定性高，操作簡單，能夠大規模地進行皮膚細胞培養 的培養液及其配制方法，以及使用該培養液進行細胞培養后得到組織工程皮膚的方法。本 專利技術的另一個目的是在培養液中加入一種防止皮膚細胞早期分化的物殊物質活化素A(即轉化生長因子A)。 本專利技術用于大規模組織工程皮膚培養的培養液含有如下組分細胞生長因子 3-30ng/mL、胰島素2_30 μ g/mL、氫化可的松0. 2-0. 6 μ g/mL、垂體提取物3_30 μ g/mL、鈣離 子 0. 5-5. 5mmol/L、轉鐵蛋白 3_30 μ g/mL、青霉素 20_60U/mL、鏈霉素 20_60mg/mL、活化素 A 0. l-0.9ng/mL。該培養液的具體配制方法如下第一步，將商用的F12粉劑和DMEM粉劑分 別配制成F12培養液和DMEM培養液；第二步，將得到的兩種培養液按照F12培養液體積百 分數為15-25%、DMEM培養液體積百分數為75-85%且兩者的體積百分數總和為100%的 比例進行充分混合得到兩者的混合液，其中所用F12和DMEM培養液的比例分別在上述范圍 內自由選擇；第三步，在得到的混合液中加入細胞生長因子、胰島素、氫化可的松、垂體提取 物、可溶鈣鹽、轉鐵蛋白、青霉素、鏈霉素和活化素A，使最終得到的混合培養液中各組分的 含量如下細胞生長因子3-30ng/mL、胰島素2_30 μ g/mL、氫化可本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于大規模產業化生產皮膚細胞的含活化素Ａ的培養液，其含有如下組分：細胞生長因子３－３０ｎｇ／ｍＬ、胰島素２－３０μｇ／ｍＬ、氫化可的松０．２－０．６μｇ／ｍＬ、垂體提取物３－３０μｇ／ｍＬ、鈣離子０．５－５．５ｍｍｏｌ／Ｌ、轉鐵蛋白３－３０μｇ／ｍＬ、青霉素２０－６０Ｕ／ｍＬ、鏈霉素２０－６０ｍｇ／ｍＬ、活化素Ａ０．１－０．９ｎｇ／ｍＬ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱寧文，
申請(專利權)人：朱寧文，
類型：發明
國別省市：32[中國|江蘇]