【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測領域，尤其涉及用于檢測定量pg13細胞dna片段大小分布的引物對及檢測方法。
技術介紹
1、近年來，隨著基因修飾技術的迅速發展，基因修飾細胞治療產品已成為醫藥領域的研究熱點。2021年2月，cde發布《基因修飾細胞治療產品非臨床研究與評價技術指導原則(試行)》，將基因修飾細胞治療產品定義為“基因修飾細胞治療產品是指經過基因修飾(如調節、修復、替換、添加或刪除等)以改變其生物學特性、擬用于治療人類疾病的活細胞產品，如基因修飾的免疫細胞(如t細胞、nk細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等)和基因修飾的干細胞(如造血干細胞、多能誘導干細胞等)等”。
2、逆轉錄病毒載體可以整合7.5kb左右外源基因整合入靶細胞基因組并穩定持久地表達，在基因治療與細胞治療領域具有廣泛的應用。在逆轉錄病毒的生產上，pg13是其常見的穩定包裝細胞系之一。1991年，a.dusty?miller等基于小鼠成纖維細胞nih?3t3構建了表達莫羅尼鼠白血病病毒(momlv)gag-pol蛋白和長臂猿白血病病毒包膜(galv-env)蛋白的逆轉錄病毒包裝細胞系pg13，該細胞系可以產生高滴度(大于106cfu/ml)、廣宿主范圍(大鼠、倉鼠、牛、貓、狗、猴和人)的逆轉錄病毒載體。有研究表明，pg13細胞系生產的逆轉錄病毒載體對于人外周血淋巴細胞具有較高的親嗜性，這可能與該逆轉錄病毒載體的galv-env與人t淋巴細胞中高表達的長臂猿白血病病毒受體(glvr-1)親和性高有關。由pg13生產得到的逆轉錄病毒載體可用于制備car-t、tcr-t
3、但在逆轉錄病毒載體的生產過程中，pg13宿主細胞殘留dna增加了中間品、成品的致瘤性、免疫原性等生物安全性風險，dna片段越大，則生物安全性風險越高。有研究表明，一個功能基因的片段長度至少為200bp。因此從產品質量控制的角度，需要pg13宿主細胞殘留dna片段的含量和片段分布情況進行監測。國內外監管機構對于疫苗中的殘留dna的量和殘留片段的大小分布等有強烈的關注。對于不同宿主細胞、給藥方式和頻率，一般允許的宿主殘留dna含量在100pg～10ng/劑之間，最大可承受量為10ng/劑；對于dna大小片段的要求則為小于一個功能基因的長度。fda要求測試成品中的殘留dna的數量和片段大小的分布情況，并在關于人類基因治療新產品生產指導文件中明確指出殘留dna的片段要小于200bp。國家藥品監督管理局(nmpa)生物制品藥學部在《基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則(征求意見稿)》中指出，殘留dna片段應小于200bp。
4、對于dna片段分布的檢測方法主要有毛細管電泳(capillary?electrophoresis，ce)法和定量pcr(qpcr)法。ce法是指以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，根據供試品中各組分淌度(單位電場強度下的遷移速度)和(或)分配行為的差異而實現分離的一種分析方法，其檢測靈敏度根據儀器、試劑的不同約為1～5pg/μl，通常用作定性分析。qpcr法是一種在dna擴增反應中，根據每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數(ct值)和標準曲線濃度，從而定量分析未知樣品核酸濃度的技術。相較于ce法，qpcr法靈敏度更高(可達fg級別)，能夠定量分析以及對dna進行種屬鑒別，已被寫入《中國藥典》、《美國藥典》的外源性dna殘留量測定方法相關章節。
5、綜上可知，生物制品行業亟需一種靈敏、穩定、高效的方法，用于分析pg13細胞基質生物制品中的宿主細胞殘留dna片段，但尚未見相關報道。2021年王俊濤等公開了一種《pg13宿主細胞dna殘留檢測試劑盒及檢測方法》，用于檢測由pg13細胞表達或生產的產品中dna殘留量。該法使用與人轉座子序列(human?alu?transposon?element)發揮相似作用的家鼠短序列b2?sequences作為pg13細胞的宿主dna檢測的靶序列，片段長度為150bp-200bp。由此可知，該靶標無法設計大片段檢測體系或體現殘留dna片段分布情況。
6、為了解決現有技術中缺乏一種靈敏、穩定、高效的方法，用于分析pg13細胞基質生物制品中的宿主細胞殘留dna片段的引物對或方法，本專利技術提供了定量檢測pg13細胞dna片段大小分布的引物對及其方法。本專利技術旨在提供一種基于實時熒光定量pcr(real-timeqpcr)技術定量檢測pg13殘留dna片段大小分布的引物對、方法和試劑盒，用于分析生物制品中間品、成品中的pg13殘留dna片段大小分布。
7、參考文獻：
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12、omori?f,juopperi?t,chan?c?k,et?al.retroviral-mediated?transfer?andexpression?of?the?multidrug?res本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.用于定量檢測PG13細胞DNA片段大小分布的引物對，其特征在于，
2.根據權利要求1所述用于定量檢測PG13細胞DNA片段大小分布的引物對，其特征在于，所述引物對選自以下引物對：
3.根據權利要求2所述用于定量檢測PG13細胞DNA片段大小分布的引物對，其特征在于，所述引物對選自以下引物對：
4.根據權利要求2或3所述用于定量檢測PG13細胞DNA片段大小分布的引物對，其特征在于，
5.用于定量檢測PG13細胞殘留DNA的檢測試劑，其特征在于，
6.根據權利要求5所述的用于定量檢測PG13細胞殘留DNA的檢測試劑，其特征在于，
7.用于定量檢測PG13細胞殘留DNA的檢測試劑盒，其特征在于，
8.一種PG13細胞殘留DNA的定量檢測方法，其特征在于，
9.權利要求1～4中任意一項所述的引物對或者如權利要求5～6所述的檢測試劑或者權利要求7所述的檢測試劑盒的用途，用于檢測待測對象中是否存在PG13細胞殘留DNA及其片段大小分布。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于
...【技術特征摘要】
1.用于定量檢測pg13細胞dna片段大小分布的引物對，其特征在于，
2.根據權利要求1所述用于定量檢測pg13細胞dna片段大小分布的引物對，其特征在于，所述引物對選自以下引物對：
3.根據權利要求2所述用于定量檢測pg13細胞dna片段大小分布的引物對，其特征在于，所述引物對選自以下引物對：
4.根據權利要求2或3所述用于定量檢測pg13細胞dna片段大小分布的引物對，其特征在于，
5.用于定量檢測pg13細胞殘留dna的檢測試劑，其特征在于，
6.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：袁小鈴，楊志行，李康凱，張琪夢，程丹妮，
申請(專利權)人：湖州申科生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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