【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及在雙水相系統(atps)中分離、濃縮和/或純化短鏈核酸片段的方法。特別地，本專利技術提供一種用于從生物材料中分離、濃縮和/或純化短鏈核酸片段的方法、一種試劑盒、和atps組分。本申請引用了各種出版物，其全部內容通過引用結合到本申請中。
技術介紹
1、自從1983年發現聚合酶鏈式反應(polymerase?chain?reaction)或簡稱pcr以來，已經對全基因組進行了測序，使得在生命科學和關鍵醫學發展的基礎研究中的諸多發現成為可能。為了使pcr效率更高、有效性更強、成本更低，整個技術創新領域因此誕生。并且由于核酸既是pcr的輸入又是輸出，因此不懈的努力已經并且正在繼續進行，以使其上游制備和下游分析更準確、更精確、更快速和更具成本效益。
2、效率的邊際收益隨著規模收益遞減而達到穩定水平。當需要分離長度小于250堿基對(bp)的小片段核酸時，這個瓶頸尤為明顯。需要對小片段核酸(na)進行分離、純化和濃縮的一個領域是最近出現的液體活檢領域。液體活檢是通過捕獲和擴增無細胞dna(cfdna)，特別是循環腫瘤dna(ctdna)，從而對處于緩解中的患者進行腫瘤發生或癌癥復發的早期診斷。循環腫瘤dna(circulating?tumor?ctdna)是一種衍生自腫瘤細胞的dna片段，其大小在100-300個堿基對之間。這些腫瘤細胞釋放的循環游離dna(cfdna)保留了原組織的特征。與常規活檢相比，分析和研究cfdna允許通過非侵入性過程對腫瘤進行遺傳學表征。cfdna分析是檢測和監測整個疾病過程中基因組變化的
3、這里的挑戰是針對生物基質的復雜背景分離、純化和濃縮非常稀有和稀疏的核酸片段。通常，相關片段的產量很低，以至于隨后的pcr結果可能沒有足夠的診斷敏感性和特異性。因此，迫切需要開發一種新的且更有效的分離、純化和濃縮小于250bp的核酸片段的方法。
4、已經開發了多種不同的方法用于從生物樣品中分離核酸，例如，涉及選擇性吸附核酸到基質的方法，以及涉及從可溶性核酸中除去污染物的方法。目前可用的純化方法基于苯酚/氯仿的使用、鹽析、離液鹽和硅樹脂的使用、親和樹脂的使用、離子交換色譜、和如美國專利號5,057,426、4,923,978、ep專利0512767a1、ep?0515484b以及wo?95/13368、wo97/10331和wo?96/18731中所述的磁珠的使用。
5、還存在通過wo2004/106516中描述的雙水相系統(atps)的已知方法來純化質粒dna和通過journal?of?chromatography?a，1082(2005)，176-184中的雙水相提取和疏水相互作用色譜來純化質粒dna載體。這兩種方法均公開了atps用于質粒dna純化的用途，但它們都沒有被設計成用于分離長度為250bp或更短的核酸。不預期用于純化大核酸分子的現有方法能夠純化具有足夠的純度的250bp或更短的短鏈核酸，以獲得令人滿意的下游應用表現。
6、制備專門用于分離、純化和濃縮250bp或更小的核酸片段的生物樣品的需要在研究和工業領域都是非常重要的，但是現有方法對這種需求基本上無法滿足。盡管已經描述了使用不同化學制劑在水相系統中實現種類分離的各種方法，但是尚未成功地嘗試將這種可能性用于以時間有效、成本有效、簡單、快速的方式分離、純化和濃縮250bp或更小的核酸片段并且提供優異的產量，而本專利技術已經證明已經實現了這一點。
技術實現思路
1、本專利技術涉及在雙水相系統(atps)中分離、濃縮和/或純化短鏈核酸片段。在一個實施例中，本專利技術提供一種使用atps分離、濃縮和/或純化具有約或少于250個堿基對(bp)的短鏈核酸片段的方法。在一個實施例中，本專利技術提供一種用于從含有核酸的生物材料中純化具有約或少于250個堿基對的短鏈核酸片段的組合物和試劑盒。在另一個實施例中，本專利技術提供一種在atps中使用特定的鹽和/或聚合物以從含有核酸的生物材料中純化具有約或少于250個堿基對的短鏈核酸片段的用途。
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1.一種用于從樣品中選擇性分離和濃縮250bp或更小的核酸片段的方法，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，進一步包括從步驟f)中的頂部相中回收所述核酸片段。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述聚合物選自由聚亞烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己內酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化淀粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機硅改性聚醚、聚N-異丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酸酯右旋糖酐、UCONTM聚合物和FicollTM聚合物組成的組。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述鹽選自由親液鹽、離液鹽、具有三甲基銨、三乙基銨、三丙基銨、三丁基銨、四甲基銨、四乙基銨、四丙基銨或四丁基銨的陽離子和磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯離子或碳酸氫根的陰離子的無機鹽、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和醋酸銨組成的組。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述第一相組分的聚合物是濃度為10-30％(w/w)的聚乙二醇PEG?1000
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述PEG?1000的濃度為15％(w/w)，并且所述磷酸氫二鉀的濃度為15％(w/w)。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述第三相組分的聚合物是濃度為5-20％(w/w)的聚乙二醇PEG?6000，并且所述第四相組分的鹽是濃度為15-25％(w/w)的磷酸氫二鉀。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述PEG?6000的濃度為8-11％(w/w)，并且所述磷酸氫二鉀的濃度為20-22％(w/w)。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述第一雙水相系統的頂部相與底部相的體積比為1：1。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述第二雙水相系統的頂部相與底部相的體積比為1：3至1：5。
11.一種用于從樣品中選擇性分離和濃縮250bp或更小的核酸片段的試劑盒，包括：
12.根據權利要求11所述的試劑盒，其中所述第一組合物的聚乙二醇PEG?1000的濃度為15％(w/w)，所述第一組合物的磷酸氫二鉀的濃度為15％(w/w)。
13.根據權利要求11或12所述的試劑盒，其中所述第二組合物的聚乙二醇PEG?6000的濃度為8-11％(w/w)，所述第二組合物的磷酸氫二鉀的濃度為20-22％(w/w)。
14.一種用于從樣品中選擇性分離和濃縮250bp或更小的核酸片段的組合物，包含第一相組分和第二相組分，當所述第一相組分和第二相組分溶解在水溶液中時能夠形成雙水相系統，其中第一相組分是在第一相中以5-20wt％的濃度溶解的聚合物，并且第二相組分是在第二相中以5-35wt％的濃度溶解的鹽，其中當所述核酸片段與所述雙水相系統混合時，將所述核酸片段濃縮在兩相中的其中一相中。
15.一種由包含第一相組分和第二相組分的組合物在從樣品中選擇性分離和濃縮250bp或更小的核酸片段的用途，當所述第一相組分和第二相組分溶解在水溶液中時能夠形成雙水相系統，其中第一相組分是在第一相中以5-20wt％的濃度溶解的分子量為1000-6000Da聚乙二醇，并且第二相組分是在第二相中以5-35wt％的濃度溶解的磷酸氫二鉀。
...【技術特征摘要】
1.一種用于從樣品中選擇性分離和濃縮250bp或更小的核酸片段的方法，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，進一步包括從步驟f)中的頂部相中回收所述核酸片段。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述聚合物選自由聚亞烷基二醇、聚(氧化烯)聚合物、聚(氧化烯)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯基己內酰胺、聚乙烯基甲基醚、烷氧基化表面活性劑、烷氧基化淀粉、烷氧基化纖維素、烷基羥烷基纖維素、有機硅改性聚醚、聚n-異丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙二醇、聚丙烯酸酯右旋糖酐、ucontm聚合物和ficolltm聚合物組成的組。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述鹽選自由親液鹽、離液鹽、具有三甲基銨、三乙基銨、三丙基銨、三丁基銨、四甲基銨、四乙基銨、四丙基銨或四丁基銨的陽離子和磷酸根、硫酸根、硝酸根、氯離子或碳酸氫根的陰離子的無機鹽、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、硫酸鈉、檸檬酸鉀、硫酸銨、檸檬酸鈉、醋酸鈉和醋酸銨組成的組。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述第一相組分的聚合物是濃度為10-30％(w/w)的聚乙二醇peg?1000，并且所述第二相組分的鹽是濃度為5-20％(w/w)的磷酸氫二鉀。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述peg?1000的濃度為15％(w/w)，并且所述磷酸氫二鉀的濃度為15％(w/w)。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述第三相組分的聚合物是濃度為5-20％(w/w)的聚乙二醇peg?6000，并且所述第四相組分的鹽是濃度為15-25％(w/w)的磷酸氫二鉀。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述peg?6000的濃度為8-11...
【專利技術屬性】
技術研發人員：招彥燾，
申請(專利權)人：相達生物科技國際有限公司，
類型：發明
國別省市：
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