【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物，尤其涉及一種pcr擴(kuò)增引物、試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、pacbio測序平臺的酶讀長在50kbp以上，但是一般擴(kuò)增子文庫的長度在2kbp以下，所以擴(kuò)增子文庫在pacbio測序平臺測序時(shí)，存在通量低，數(shù)據(jù)浪費(fèi)現(xiàn)象。為了增加pacbio數(shù)據(jù)利用率，有文獻(xiàn)報(bào)道，利用無縫克隆技術(shù)(golden?gate?assembly)將5段dna擴(kuò)增序列定向連接在一起，然后在pacbio建庫測序(nisha?kanwar等2021，scientific?reports，1-5)，增加了擴(kuò)增子文庫約5倍ccs產(chǎn)出。
2、另一篇文獻(xiàn)(aziz?m.al’khafaji，2021)中報(bào)道，全長轉(zhuǎn)錄組在pacbio平臺測序時(shí)，同樣存在長度限制，通過定向串聯(lián)15倍，使sequel?iie測序儀產(chǎn)出40million?cdnareads，產(chǎn)量提升了約15倍左右。此全長轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增產(chǎn)物在擴(kuò)增引物兩端引入帶u的序列，再通過user酶形成粘性末端，粘性末端在連接酶作用下利用堿基互補(bǔ)配對原則，重新形成3-5磷酸鍵，則定向串聯(lián)在一起。
3、雖然目前已報(bào)道了一些擴(kuò)增序列在pacbio平臺的串聯(lián)方法，但尚未有微生物多樣性的定向串聯(lián)報(bào)道。
4、采用dna擴(kuò)增子的無縫克隆技術(shù)并利用限制性內(nèi)切酶形成粘性末端，并用連接酶進(jìn)行連接，后續(xù)結(jié)果顯示連接特異性較低，目的片段得率較低。
5、鑒于此，申請此專利。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供一種pcr擴(kuò)增引物、試劑盒及其
2、本專利技術(shù)提供一種pcr擴(kuò)增引物，所述pcr擴(kuò)增引物包括上游引物ⅰ和下游引物ⅰ，所述上游引物ⅰ包括：masf_a3、masf_b、masf_c、masf_d、masf_e、masf_f、masf_g、masf_h、masf_i和/或masf_j；
3、所述下游引物ⅰ包括：masr_b’、masr_c’、masr_d’、masr_e’、masr_f’、masr_g’、masr_h’、masr_i’、masr_j’和/或masr_k’3；
4、所述pcr擴(kuò)增引物是由所述上游引物ⅰ和所述下游引物ⅰ組成的若干個(gè)引物對；
5、所述masf_a3的序列如seq?id?no:1所示；
6、所述masf_b的序列如seq?id?no:2所示；
7、所述masf_c的序列如seq?id?no:3所示；
8、所述masf_d的序列如seq?id?no:4所示；
9、所述masf_e的序列如seq?id?no:5所示；
10、所述masf_f的序列如seq?id?no:6所示；
11、所述masf_g的序列如seq?id?no:7所示；
12、所述masf_h的序列如seq?id?no:8所示；
13、所述masf_i的序列如seq?id?no:9所示；
14、所述masf_j的序列如seq?id?no:10所示；
15、所述masf_b’的序列如seq?id?no:11所示；
16、所述masf_c’的序列如seq?id?no:12所示；
17、所述masf_d’的序列如seq?id?no:13所示；
18、所述masf_e’的序列如seq?id?no:14所示；
19、所述masf_f’的序列如seq?id?no:15所示；
20、所述masf_g’的序列如seq?id?no:16所示；
21、所述masf_h’的序列如seq?id?no:17所示；
22、所述masf_i’的序列如seq?id?no:18所示；
23、所述masf_j’的序列如seq?id?no:19所示；
24、所述masf_k’的序列如seq?id?no:20所示。
25、具體的，pcr擴(kuò)增引物中的上游引物ⅰ和下游引物ⅰ的序列如下表1：
26、表1?pcr擴(kuò)增引物的序列
27、
28、
29、pcr擴(kuò)增引物可以是從中選擇若干個(gè)引物對即可，根據(jù)pacbio測序(或其他測序平臺)酶讀長與擴(kuò)增目的片段長度決定。如果是采用三代pacbio測序平臺，則引物對的個(gè)數(shù)需要考慮到三代pacbio的酶讀長，根據(jù)酶讀長選定的上面的10個(gè)，酶讀長按照50k/目的片段大小，k＝擴(kuò)增引物對。
30、本專利技術(shù)中的pcr擴(kuò)增引物構(gòu)建方式：
31、上游引物結(jié)構(gòu)f5′-3′：17nt含兩個(gè)u序列+22nt搭橋序列；
32、下游引物結(jié)構(gòu)r5′-3′:17nt含兩個(gè)u序列+22nt搭橋序列。
33、在一些實(shí)施例中，所述pcr擴(kuò)增引物用于對微生物的16s基因擴(kuò)增子18s基因擴(kuò)增子和/或its擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增。
34、在一些實(shí)施例中，所述上游引物ⅰ還包括：masf_k、masf_l、masf_m、masf_n、masf_o和/或masf_p；
35、所述下游引物ⅰ還包括：masr_k’、masr_l’、masr_m’、masr_n’、masr_o’、masr_p’和/或masr_q’；
36、所述masf_k的序列如seq?id?no:21所示；
37、所述masf_l的序列如seq?id?no:22所示；
38、所述masf_m的序列如seq?id?no:23所示；
39、所述masf_n的序列如seq?id?no:24所示；
40、所述masf_o的序列如seq?id?no:25所示；
41、所述masf_p的序列如seq?id?no:26所示；
42、所述masr_k’的序列如seq?id?no:27所示；
43、所述masr_l’的序列如seq?id?no:28所示；
44、所述masr_m’的序列如seq?id?no:29所示；
45、所述masr_n’的序列如seq?id?no:30所示；
46、所述masr_o’的序列如seq?id?no:31所示；
47、所述masr_p’的序列如seq?id?no:32所示；
48、所述masr_q’的序列如seq?id?no:33所示。
49、用于pcr擴(kuò)增的其他引物序列masf_k、masf_l、masf_m、masf_n、masf_o、masf_p、masr_k’、masr_l’、masr_m’、masr_n’、masr_o’、masr_p’和masr_q’的序列如下表2：
50、表2?pcr擴(kuò)增的其他引物序列
51、 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種PCR擴(kuò)增引物，所述PCR擴(kuò)增引物包括上游引物Ⅰ和下游引物Ⅰ，其特征在于，所述上游引物Ⅰ包括：MasF_A3、MasF_B、MasF_C、MasF_D、MasF_E、MasF_F、MasF_G、MasF_H、MasF_I和/或MasF_J；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增引物用于對16S基因擴(kuò)增子、18S基因擴(kuò)增子和/或ITS擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述上游引物Ⅰ還包括：MasF_K、MasF_L、MasF_M、MasF_N、MasF_O和/或MasF_P；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增引物用于對ITS基因擴(kuò)增子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，將微生物的基因進(jìn)行擴(kuò)增得到基因擴(kuò)增子，
6.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-5任一所述的PCR擴(kuò)增引物；
7.一種權(quán)利要求1-5任一所述的PCR擴(kuò)增引物或權(quán)利要求6所述的試劑盒
8.一種微生物擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：先對微生物的基因進(jìn)行擴(kuò)增得到基因擴(kuò)增子，然后采用權(quán)利要求1-5任一所述的PCR擴(kuò)增引物或權(quán)利要求6所述的試劑盒對所述基因擴(kuò)增子進(jìn)行定向串聯(lián)處理，得到串聯(lián)產(chǎn)物，再對所述串聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行建庫。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，通過MAS-PCR對所述基因擴(kuò)增子進(jìn)行定向串聯(lián)處理；
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的微生物擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，先對微生物基因全長進(jìn)行擴(kuò)增，然后在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中選取目的基因，通過MAS-PCR對所述目的基因的核酸序列進(jìn)行定向串聯(lián)處理。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種pcr擴(kuò)增引物，所述pcr擴(kuò)增引物包括上游引物ⅰ和下游引物ⅰ，其特征在于，所述上游引物ⅰ包括：masf_a3、masf_b、masf_c、masf_d、masf_e、masf_f、masf_g、masf_h、masf_i和/或masf_j；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的pcr擴(kuò)增引物，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增引物用于對16s基因擴(kuò)增子、18s基因擴(kuò)增子和/或its擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的pcr擴(kuò)增引物，其特征在于，所述上游引物ⅰ還包括：masf_k、masf_l、masf_m、masf_n、masf_o和/或masf_p；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pcr擴(kuò)增引物，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增引物用于對its基因擴(kuò)增子進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的pcr擴(kuò)增引物，其特征在于，將微生物的基因進(jìn)行擴(kuò)增得到基因擴(kuò)增子，
6.一種試劑盒，其...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭洪坤，張雪川，苗娟，畢經(jīng)德，
申請(專利權(quán))人：北京百邁客生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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