【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于酶工程和生物，具體涉及一種pet水解酶突變體及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、聚對苯二甲酸乙二醇酯（pet）是一種常見的塑料，由取自原油的對苯二甲酸（tpa）和乙二醇（eg）通過酯鍵相連構(gòu)成。pet制品由于其可塑性以及穩(wěn)定性高，目前已被廣泛應(yīng)用到食品、藥品、化妝品包裝等領(lǐng)域，其產(chǎn)生的廢棄物數(shù)量巨大，是白色污染的主要來源之一。由于其穩(wěn)定性高，pet廢棄物在自然條件下需要數(shù)百年才能完全分解，導(dǎo)致在全球生態(tài)系統(tǒng)中累積并入侵人類食物鏈，嚴重威脅到生態(tài)系統(tǒng)和人類健康。
2、通過生物酶法對pet塑料進行回收是一種綠色理想的處理方法，為解決pet廢棄污染提供了新契機。目前，已經(jīng)鑒定出許多酯酶、脂肪酶或角質(zhì)酶形式的pet水解酶，其中ispetase、lcc是研究最廣泛的塑料降解酶，許多研究團隊基于這兩個野生型pet水解酶開發(fā)了穩(wěn)定性更高的酶突變體，例如durapetase，hotpetase，fastpetase，depopetase，和lcciccg，但由于ispetase、lcc自身結(jié)構(gòu)限制，他們的突變體降解pet的能力已經(jīng)到達一個瓶頸，尚缺乏更多優(yōu)秀的pet水解酶改造模板。并且目前所報道的pet水解酶都只含有一個pet水解結(jié)構(gòu)域，缺乏底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這也是限制pet水解酶活性的重要因素。近期，本團隊在micromonospora?sp.?hm5-17中發(fā)現(xiàn)了一種新型pet水解酶lspet4，除了pet水解結(jié)構(gòu)域外還含有碳水化合物結(jié)構(gòu)域（cbm），且與常見的pet水解酶相比，lspet4水解酶與底物結(jié)合構(gòu)象為直線構(gòu)象，這區(qū)
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的第一目的在于通過對pet水解酶lspet4結(jié)構(gòu)研究，結(jié)合定向進化技術(shù)，提供一種pet水解酶突變體，該突變體具有更好的酶活，可提升pet水解酶的工業(yè)應(yīng)用價值。
2、為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、一種pet水解酶突變體，其氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
4、本專利技術(shù)的第二目的在于提供編碼上述pet水解酶突變體的核苷酸序列，一個可選的方案如seq?id?no：2所示。
5、本專利技術(shù)的第三目的在于提供包含上述核苷酸序列的重組載體。優(yōu)選的，選用pet-22b質(zhì)粒構(gòu)建所述重組載體。
6、本專利技術(shù)的第四目的在于提供包含上述重組載體的工程菌株。優(yōu)選的，選用大腸桿菌作為宿主菌構(gòu)建所述工程菌株。
7、本專利技術(shù)的第五目的在于提供上述pet水解酶突變體在水解pet中的應(yīng)用。
8、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述應(yīng)用包括：在pet的溶液中加入所述pet水解酶突變體，進行pet水解。
9、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述pet的溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液和有機溶劑的混合液。優(yōu)選的，所述有機溶劑為二甲基亞砜。
10、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述pet水解酶突變體在30℃-55℃范圍內(nèi)水解pet；優(yōu)選45-55℃。
11、作為一種優(yōu)選的實施方式，所述pet水解酶突變體在ph7.4-8.0環(huán)境下水解pet。
12、在對現(xiàn)有l(wèi)spet4結(jié)構(gòu)研究過程中，專利技術(shù)人認為現(xiàn)有l(wèi)spet4蛋白的第96位、第127位、第130位、第241位這四個位點位于酶的催化口袋，因此對這四個位點氨基酸進行定向突變后，有利于底物與酶活性口袋的直線型結(jié)合，從而有利于提高lspet4的酶活性能；第209位、第238位點位于酶分子表面，對這兩個氨基酸進行突變后有利于鹽橋的形成，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；基于上述六個點位，將lspet4突變酶，命名為lspet。實驗結(jié)果表明突變酶增加了對pet的水解活性，使用突變酶進行降解pet反應(yīng)，可以使降解pet反應(yīng)的產(chǎn)量提升，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價值。
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1.一種PET水解酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述PET水解酶突變體的核苷酸序列。
3.包含權(quán)利要求2所述核苷酸序列的重組載體。
4.包含權(quán)利要求3所述重組載體的工程菌株。
5.權(quán)利要求1所述PET水解酶突變體在水解PET中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：在PET的溶液中加入所述PET水解酶突變體，進行PET水解。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PET的溶液的溶劑為磷酸鹽緩沖液和有機溶劑的混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機溶劑為二甲基亞砜。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PET水解酶突變體在30℃-55℃范圍內(nèi)水解PET；優(yōu)選45-55℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述PET水解酶突變體在pH7.4-8.0環(huán)境下水解PET。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種pet水解酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述pet水解酶突變體的核苷酸序列。
3.包含權(quán)利要求2所述核苷酸序列的重組載體。
4.包含權(quán)利要求3所述重組載體的工程菌株。
5.權(quán)利要求1所述pet水解酶突變體在水解pet中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：在pet的溶液中加入所述pet水解酶突變體，進行pe...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：江凌，李闖，劉偉，朱麗英，
申請(專利權(quán))人：南京工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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