本發明專利技術提供了一種提高識別和殺傷腫瘤能力的工程化TIL細胞及其應用。本發明專利技術涉及基因工程及細胞治療技術領域。本發明專利技術的工程化TIL細胞表面含有外源的膜結合型的DAP10?CD3ζ融合蛋白，其內質網或高爾基體中含有滯留型融合蛋白。具體地，本發明專利技術提供了一種膜結合型DAP10?CD3ζ融合蛋白，使TIL細胞通過NKG2D?NKG2DL途徑識別腫瘤細胞后，可以被本發明專利技術的激活型融合蛋白激活，從而對腫瘤細胞進行有效殺傷。本發明專利技術還提供了滯留型融合蛋白，使TIL細胞激活時表達的內源NKG2DL能與本發明專利技術的滯留型融合蛋白結合，從而滯留在細胞內，避免了TIL細胞間的相互識別和殺傷，提升了TIL細胞的活率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程及細胞治療，具體地涉及提高識別和殺傷腫瘤能力的工程化til細胞及其應用。
技術介紹
1、腫瘤浸潤淋巴細胞(til)細胞療法是指從腫瘤組織中分離腫瘤浸潤的淋巴細胞，在體外培養和大量擴增后回輸到病人體內的療法。til由具有多種個tcr克隆的t細胞組成，可以識別多個腫瘤特異性的新生抗原及腫瘤相關抗原，使其更有效地應對腫瘤異質性。til通常含有一定效應性記憶性t細胞，在體內被腫瘤抗原刺激后表達趨化因子受體，使其在回輸后更容易定位于腫瘤組織。此外，til來源于患者自身，具有較低的毒性。til療法在實體瘤領域內表現出了巨大的潛力。
2、來源腫瘤組織的til細胞富含腫瘤特異性t細胞，然而，這些腫瘤特異性t細胞在腫瘤特異性激活后往往處于終末分化、耗竭狀態，導致til細胞對腫瘤細胞的殺傷能力減弱。此外，培養出來的til細胞中有大部分細胞是非腫瘤特異性的旁觀者細胞，如何將旁觀者細胞轉變為對腫瘤細胞具有識別和殺傷功能的效應細胞是亟待解決的問題。此外，腫瘤細胞往往降低mhc-i分子的表達或tap基因突變等導致抗原遞呈功能喪失等，從而逃逸免疫細胞的殺傷。
3、til細胞表面的nkg2d分子可以結合腫瘤細胞表面的nkg2dl分子，從而使til細胞識別腫瘤細胞。然而，til細胞在激活狀態下會短暫表達nkg2dl，這使得til細胞之間存在互相殘殺，導致til細胞活力顯著下降。
4、因此，本領域迫切需要開發對腫瘤細胞具有識別和殺傷腫瘤細胞功能、減少免疫逃逸、并能減少til細胞自相殘殺的工程化til細胞。</p>
技術實現思路
1、本專利技術的目的就是提供對腫瘤細胞具有識別和殺傷腫瘤細胞功能、減少免疫逃逸、并能減少til細胞自相殘殺的工程化til細胞及其應用。
2、在本專利技術的第一方面，提供了一種工程化腫瘤浸潤淋巴細胞(til細胞)，所述工程化til細胞表達選自下組的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滯留型融合蛋白、或其組合；
3、其中，所述激活型融合蛋白為膜結合型dap10-cd3ζ融合蛋白；
4、所述滯留型融合蛋白包括：nkg2d胞外區和kdel序列。
5、在另一優選例中，所述工程化til細胞表達激活型融合蛋白和滯留型融合蛋白。
6、在另一優選例中，所述激活型融合蛋白包括：(1)?胞外結構域，所述胞外結構域包含dap10元件或其活性片段；
7、(2)?跨膜域；和
8、(3)?胞內信號域，所述胞內信號域包含dap10胞內結構域和cd3ζ；
9、其中，所述胞外結構域和胞內信號域，通過所述跨膜域串聯在一起。
10、在另一優選例中，所述的工程化til細胞的細胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化til細胞的內質網或高爾基體中具有所述的滯留型融合蛋白。
11、在另一優選例中，所述工程化til細胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述的激活型融合蛋白和/或所述的滯留型融合蛋白。
12、在另一優選例中，所述工程化til細胞含有一核酸構建物，所述核酸構建物包含第一表達盒，所述第一表達盒包含編碼所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或編碼所述的滯留型融合蛋白的多核苷酸。
13、在另一優選例中，所述工程化til細胞含有一載體，所述載體包含：編碼所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或編碼所述的滯留型融合蛋白的多核苷酸。
14、在另一優選例中，所述工程化til細胞還表達膜結合型il-15融合蛋白，其包括以下元件：
15、(i)?白細胞介素15或其功能活性片段；
16、(ii)?跨膜域；和
17、(iii)?胞內域；
18、其中，所述胞內域為cd86胞內域。
19、在另一優選例中，所述cd86胞內域包括全長胞內域、或其活性片段。
20、在另一優選例中，所述il-15包括全長的、成熟形式的il-15、或其活性片段。
21、在另一優選例中，所述il-15包括野生型和突變型。
22、在另一優選例中，所述il-15的氨基酸序列如seq?id?no:?6所示。
23、在另一優選例中，所述融合多肽進一步包括鉸鏈區。
24、在另一優選例中，所述融合多肽進一步可選地包括信號肽和/或連接子(linker)。
25、在另一優選例中，所述連接子位于所述元件(i)和元件(ii)之間，元件(ii)和元件(iii)之間，元件(i)和鉸鏈區之間，或者鉸鏈區和元件(ii)之間。
26、在另一優選例中，所述連接子包括柔性連接子或剛性連接子。
27、在另一優選例中，所述連接子的氨基酸序列如為seq?id?no:?7所示。
28、在另一優選例中，所述融合多肽的結構式如式(i)所示：
29、x-il15-l-h-tm-cyto??(i)
30、其中，
31、“-”各自獨立地為無或連接肽；
32、x為無或信號肽；
33、il15為白細胞介素15元件；
34、l為無或連接子；
35、h為鉸鏈區；
36、tm為跨膜域；
37、cyto為胞內域，其中所述胞內域為cd86胞內域。
38、在另一優選例中，所述跨膜域為cd86跨膜域。
39、在另一優選例中，所述cd86跨膜域和胞內域的氨基酸序列如seq?id?no:?9所示。
40、在另一優選例中，所述鉸鏈區為cd86鉸鏈區，優選地，所述cd86鉸鏈區的氨基酸序列如seq?id?no:?7所示。
41、在另一優選例中，所述信號肽的氨基酸序列如seq?id?no:?5所示。
42、在另一優選例中，所述工程化til細胞具有選自下組的一個或多個性能：
43、(1)?增強的識別和殺傷腫瘤細胞的能力；
44、(2)?減少激活的til細胞間相互識別和殺傷的能力；
45、(3)?擴大的til細胞識別靶抗原譜；
46、(4)?有效防止腫瘤的免疫逃逸和復發。
47、在本專利技術第二方面，提供了一種激活型融合蛋白，所述激活型融合蛋白包括：
48、(1)?胞外結構域，所述胞外結構域包含dap10元件或其活性片段；
49、(2)?跨膜域；和
50、(3)?胞內信號域，所述胞內信號域包含dap10胞內結構域和cd3ζ；
51、其中，所述胞外結構域和胞內信號域，通過所述跨膜域串聯在一起。
52、在另一優選例中，在胞內信號域中，dap10胞內結構域和cd3ζ直接相連或通過連接肽連接。(較佳地，所述連接肽的長度為1-10aa，較佳地1-6aa，更佳地1-3aa)。
53、在另一優選例中，所述胞內信號域進一步包括共刺激域。
54、在另一優選例本文檔來自技高網
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【技術保護點】
1.一種提高識別和殺傷腫瘤能力的工程化TIL細胞，其特征在于，所述工程化TIL細胞表達選自下組的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滯留型融合蛋白、或其組合；
2.?如權利要求1所述的工程化TIL細胞，其特征在于，所述激活型融合蛋白包括：(1)胞外結構域，所述胞外結構域包含DAP10元件或其活性片段；
3.如權利要求1所述的工程化TIL細胞，其特征在于，所述的工程化TIL細胞的細胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化TIL細胞的內質網或高爾基體中具有所述的滯留型融合蛋白。
4.如權利要求1所述的工程化TIL細胞，其特征在于，所述工程化TIL細胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述的激活型融合蛋白和/或所述的滯留型融合蛋白。
5.如權利要求1所述的工程化TIL細胞，其特征在于，所述工程化TIL細胞含有一核酸構建物，所述核酸構建物包含第一表達盒，所述第一表達盒包含編碼所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或編碼所述的滯留型融合蛋白的多核苷酸。
6.如權利要求1所述的工程化TIL細胞，其特征在于，所述工程化TIL細胞含有一載體，所述載體包含：編碼所述的激活型融合蛋白的多核苷酸和/或編碼所述的滯留型融合蛋白的多核苷酸。
7.如權利要求1所述的工程化TIL細胞，其特征在于，所述工程化TIL細胞還表達膜結合型IL-15融合蛋白，其包括以下元件：
8.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含權利要求1所述的工程化TIL細胞和藥學上可接受的載體。
9.?一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1所述的工程化TIL細胞，或用于制備權利要求1所述的工程化TIL細胞的試劑，其中，所述試劑選自下組：
10.權利要求1所述的工程化TIL細胞、或權利要求9所述的試劑盒在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療腫瘤。
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【技術特征摘要】
1.一種提高識別和殺傷腫瘤能力的工程化til細胞，其特征在于，所述工程化til細胞表達選自下組的外源融合蛋白：激活型融合蛋白、滯留型融合蛋白、或其組合；
2.?如權利要求1所述的工程化til細胞，其特征在于，所述激活型融合蛋白包括：(1)胞外結構域，所述胞外結構域包含dap10元件或其活性片段；
3.如權利要求1所述的工程化til細胞，其特征在于，所述的工程化til細胞的細胞膜上具有所述的激活型融合蛋白；和/或所述的工程化til細胞的內質網或高爾基體中具有所述的滯留型融合蛋白。
4.如權利要求1所述的工程化til細胞，其特征在于，所述工程化til細胞含有一多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述的激活型融合蛋白和/或所述的滯留型融合蛋白。
5.如權利要求1所述的工程化til細胞，其特征在于，所述工程化til細胞含有一核酸構建物，所述核酸構建物包含第一表達盒，所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許傲天，于忠杰，蔣彬，朱月姝，邵琳，李斌，宋宇，孫振，劉文娜，吳昊，趙毅，高青，
申請(專利權)人：青島華賽伯曼醫學細胞生物有限公司，
類型：發明
國別省市：
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