【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，屬于干細(xì)胞的分離、誘導(dǎo)、分化、培養(yǎng)。
技術(shù)介紹
1、神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元和/或其髓鞘的喪失所致，隨著時(shí)間的推移而惡化，出現(xiàn)功能障礙。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類健康。神經(jīng)細(xì)胞損傷很難自行修復(fù)，而機(jī)體自身有限的再生能力亦不能滿足修復(fù)損傷的需求。目前，對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的治療，臨床一般采用細(xì)胞營養(yǎng)療法或藥物改善癥狀，尚無有效的治療方法。神經(jīng)退行性疾病的治療是臨床難以解決的問題。
2、隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞移植療法成為研究熱點(diǎn)。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。可以通過體外分離獲得自體、同種異體或異種的干細(xì)胞，將其回輸給患者，以治療相關(guān)疾病。目前，神經(jīng)干細(xì)胞主要從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)或是直接從哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離培養(yǎng)獲得，但存在倫理學(xué)、安全性問題，并且細(xì)胞來源和數(shù)量有限，在一定程度上限制了神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。因此，有必要尋找其它能夠獲得神經(jīng)干細(xì)胞的途徑來克服這些限制。
3、目前報(bào)道的干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法很多，主要有：(1)化學(xué)誘導(dǎo)劑法，如二甲基亞砜、丁基羥基茴香醚、β-巰基乙醇等；(2)生長因子誘導(dǎo)法，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子等；(3)生長因子與化學(xué)誘導(dǎo)劑聯(lián)合，如神經(jīng)生長因子與維甲酸聯(lián)合誘導(dǎo)；(4)共培養(yǎng)或用接近生理狀態(tài)的條件培養(yǎng)基；(5)中藥成分如黃芩苷、丹參等。
4、臍血干細(xì)胞是存在于新生兒臍帶血的一種多能干細(xì)胞,具有強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，其來源豐富、免疫原
5、維甲酸(retinoic?acid，ra)是維生素a的衍生物，能夠增加神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量并呈劑量依賴效應(yīng)，可調(diào)節(jié)表皮生長因子反應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞生成。目前研究維甲酸誘導(dǎo)的多為胚胎干細(xì)胞，且需要應(yīng)用不同組分基質(zhì)膠模擬體內(nèi)微環(huán)境，尚未見應(yīng)用維甲酸誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，以及在無基質(zhì)膠微環(huán)境下誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)提供了一種誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法。本專利技術(shù)采用維甲酸誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。
2、本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
3、一種誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：
4、(1)取臍血干細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，均勻鋪于培養(yǎng)皿，在37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～30h；
5、(2)棄掉原培養(yǎng)基，加入維甲酸及培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，隔天更換維甲酸及培養(yǎng)基1次，在37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，激光共聚焦顯微鏡觀察，即可見有神經(jīng)干細(xì)胞；維甲酸的濃度為0.5～2.0μm，優(yōu)選1μm。
6、進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，臍血干細(xì)胞為初代或第1～4代的臍血干細(xì)胞，優(yōu)選第4代的臍血干細(xì)胞。
7、更進(jìn)一步地，所述初代的臍血干細(xì)胞可通過以下方式獲得：將臍血與ficoll分離液混合，離心，吸取中間薄層單核細(xì)胞，用pbs清洗3次，得到單核細(xì)胞，即為臍血干細(xì)胞。具體地，向無菌離心管中加入20ml的ficoll分離液，緩慢加入臍血20ml，離心(500g，30min，升速：2，降速：1)；用吸管吸棄上層血漿，吸取中間薄層單核細(xì)胞，用pbs緩沖液清洗3次，得到單核細(xì)胞，即為臍血干細(xì)胞。所述用pbs緩沖液清洗的具體方式為：吸取中間薄層單核細(xì)胞，加入10ml的pbs，輕彈離心管，使細(xì)胞懸浮，離心，300g，10min，升速：2，降速：5。
8、更進(jìn)一步地，分離得到臍血干細(xì)胞后，進(jìn)行流式免疫表型鑒定，流式免疫表型鑒定使用的抗體選自以下之一或兩種以上：cd14、cd19、cd29、cd34、cd44、cd73、cd90、cd105、hla-dr、igg1-pe、igg1-fitc。
9、進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，加入培養(yǎng)基后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞/ml。
10、進(jìn)一步地，所述步驟(1)、(2)中，培養(yǎng)基為常規(guī)的干細(xì)胞培養(yǎng)基，或額外添加有營養(yǎng)因子mesencuittm-acf?plus?supplemen、l-glutamine和雙抗生素的干細(xì)胞培養(yǎng)基。所述常規(guī)的干細(xì)胞培養(yǎng)基可以是間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(mesenculttm-acf?plus)，該培養(yǎng)基是一種商品化的、標(biāo)準(zhǔn)化的、無動(dòng)物成分和無血清培養(yǎng)基。
11、進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，維甲酸及培養(yǎng)基以維甲酸誘導(dǎo)液的形式加入；維甲酸誘導(dǎo)液由維甲酸和培養(yǎng)基組成，維甲酸的濃度為0.5～2.0μm，優(yōu)選1μm，可通過以下方法配制：取2mg?ra，加入6.66ml?dmso，得濃度為1000μm母液；取10μl母液，加9.99ml培養(yǎng)基，過濾除菌，得濃度為1μm的維甲酸誘導(dǎo)液。
12、進(jìn)一步地，還包括步驟(3)：培養(yǎng)3天后，進(jìn)行免疫熒光檢測。進(jìn)行免疫熒光檢測所采用的一抗為nestin(1:200)與neun(1:100)標(biāo)記，所采用的二抗為alexa?fluor?488標(biāo)記山羊抗兔igg(h+l)(1:200)，或cy3標(biāo)記山羊抗小鼠igg(h+l)(1:200)。
13、本專利技術(shù)的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，采用維甲酸誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。本專利技術(shù)未使用具有細(xì)胞毒性的化學(xué)物質(zhì)，不會(huì)引起假陽性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。本專利技術(shù)未使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，因此不會(huì)產(chǎn)生插入突變。本專利技術(shù)也未使用神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，因此不存在目標(biāo)細(xì)胞難以分離和潛在外源病原體的問題。本專利技術(shù)未使用常規(guī)原代細(xì)胞培養(yǎng)所涉及的基質(zhì)膠，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，增加結(jié)果的穩(wěn)定性與可信性，避免因使用基質(zhì)膠導(dǎo)致內(nèi)毒素、支原體、細(xì)菌、真菌污染；后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)可與任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基兼容。在本專利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)用本方法提取培養(yǎng)的臍血干細(xì)胞在無基質(zhì)膠情況仍然貼壁牢固，活性正常且增殖速度快，隔天即可增殖1倍，在擴(kuò)增多倍后選用第4代時(shí)仍可進(jìn)行誘導(dǎo)分化。
14、本專利技術(shù)的臍血干細(xì)胞誘導(dǎo)向神經(jīng)干細(xì)胞的分化方法，明確了臍血干細(xì)胞分離的實(shí)驗(yàn)條件，明確了誘導(dǎo)因子的使用濃度，為臍血干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)的研究提供了一個(gè)低成本和高效率的操作方法。本專利技術(shù)對(duì)體外誘導(dǎo)分化獲得神經(jīng)干細(xì)胞的研究具有重要意義和應(yīng)用潛力。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，臍血干細(xì)胞為初代或第1～4代的臍血干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所述初代的臍血干細(xì)胞通過以下方式獲得：將臍血與Ficoll分離液混合，離心，吸取中間薄層單核細(xì)胞，清洗3次，得到單核細(xì)胞，即為臍血干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：分離得到臍血干細(xì)胞后，進(jìn)行流式免疫表型鑒定，流式免疫表型鑒定使用的抗體選自以下之一或兩種以上：CD14、CD19、CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-DR、IgG1-PE、IgG1-FITC。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，加入培養(yǎng)基后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述培養(yǎng)基為MesencultTM-ACF?plus培養(yǎng)基；或由MesencultTM-ACF?plus培養(yǎng)基、營養(yǎng)因子MesencuitTM-ACF?Plus?Supplemen、L-Glutamine和雙抗生素組成的培養(yǎng)基，其中，每50mL的MesencultTM-ACF?plus培養(yǎng)基中添加0.1mL營養(yǎng)因子MesencuitTM-ACF?Plus?Supplement、0.2mM?L-Glutamine和500μL雙抗生素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)、(2)中，培養(yǎng)條件為：37℃、5％CO2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，維甲酸及培養(yǎng)基以維甲酸誘導(dǎo)液的形式加入；維甲酸誘導(dǎo)液由維甲酸和培養(yǎng)基組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于，還包括步驟(3)：培養(yǎng)3天后，進(jìn)行免疫熒光檢測；進(jìn)行免疫熒光檢測所采用的一抗為：Nestin與NeuN標(biāo)記；所采用的二抗為Alexa?Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG，或Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，臍血干細(xì)胞為初代或第1～4代的臍血干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所述初代的臍血干細(xì)胞通過以下方式獲得：將臍血與ficoll分離液混合，離心，吸取中間薄層單核細(xì)胞，清洗3次，得到單核細(xì)胞，即為臍血干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：分離得到臍血干細(xì)胞后，進(jìn)行流式免疫表型鑒定，流式免疫表型鑒定使用的抗體選自以下之一或兩種以上：cd14、cd19、cd29、cd34、cd44、cd73、cd90、cd105、hla-dr、igg1-pe、igg1-fitc。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，加入培養(yǎng)基后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105細(xì)胞/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)臍血干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法，其特征在于：所述步驟(1)、(2)中，培養(yǎng)基為間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，或添加有營養(yǎng)因子mesencuittm-acf?plussupplemen、l-glutamine和雙抗...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張癸榮，李明月，王天，張策，賈雪，鄭欽品，
申請(專利權(quán))人：銀豐生物工程集團(tuán)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。