一種藻藍蛋白提取物的制備和應用制造技術

本發明專利技術屬于醫藥技術領域，具體說是一種藻藍蛋白提取物的制備和應用。藻藍蛋白提取物將螺旋藻粉在－２０℃～４℃下通過反復凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到粗提物；用質量分數為５０－６０％的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質粗提物；而后采用雙水相萃取純化蛋白質粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。主要由藻藍蛋白組成，其水溶液的吸光度特點為Ａ６２０／２８０≈３．０±０．２，Ａ６２０／６５０≈２．２±０．１。本發明專利技術主要結合硫酸銨沉淀、雙水相萃取和透析除鹽等方法得到了藻藍蛋白提取物，并將所得藻藍蛋白提取物對Ｓ１８０肉瘤小鼠進行不同劑量給藥，表現出良好的腫瘤抑制效果，并且對脾臟和胸腺并沒有表現出明顯的毒性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于醫藥
，具體說是一種藻藍蛋白提取物的制備和應用。
技術介紹
螺旋藻是一種食品巨型藻，其營養價值得到了廣泛報道。作為螺旋藻中的主要蛋 白組成，藻藍蛋白由α、β兩種脫輔基蛋白和色基組成，在620nm具有最大吸收，在640nm 具有較強的紅色熒光特性。基于水溶性好，熒光強度高和抗氧化等性能，藻藍蛋白既可以作 為天然色素添加劑應用于食品和化妝品工業，同時又可以開發成熒光試劑用于醫學診斷、 免疫化學及生物工程等研究領域，另外作為一種重要的生理活性成分，還可以制成藥品用 于醫療保健上。目前，藻藍蛋白的制備方法主要包括離子交換層析和凝膠過濾層析。這兩 種方法操作繁瑣，很難實現大規模生產。因此，在保證蛋白活性的基礎上，研發高效、經濟可 以大規模制備的分離技術成為藻藍蛋白開發的關鍵。鑒于藻藍蛋白不僅可以提供人體必需的氨基酸，而且對腫瘤細胞有較強的親和 力，對多種腫瘤細胞表現出顯著的殺傷效果，其營養及藥學價值得到了廣泛報道。最近的諸 多數據表明，藻藍蛋白具有抗氧化特性，并在涉及到活性氧的炎癥，動脈粥樣硬化，癌癥等 多種疾病的防治中表現出良好的藥效。在十二種炎癥模型中，藻藍蛋白都表現出與劑量依 存的消炎活性。利用其清除活性氧，抑制環氧酶_2活性和柱狀細胞中組氨釋放等作用。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種藻藍蛋白提取物的制備和應用。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為一種藻藍蛋白提取物將螺旋藻粉在-20°C 4°C下通過反復凍融法破碎螺旋藻 細胞壁得到粗提物；用質量分數為50-60%的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質粗提物；而后 采用雙水相萃取純化蛋白質粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。所述藻藍蛋白提取物水溶液的吸光度特點為A6w28tl ^ 3. 0 士 0. 2， A6207650 ^ 2. 2士0. 1。所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水， 微溶于乙醇和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、 干燥的條件下可長期保存。制備方法將螺旋藻粉在-20°C 4°C下通過反復凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到 粗提物；用質量分數為50-60%的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質粗提物；而后采用雙水相 萃取純化蛋白質粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。所述藻藍蛋白提取物溶液冷凍干燥，即得到藻藍蛋白提取物。所述雙水相萃取的 水相質量組成分別為4%的PEG、15%的氯化鉀和10%的pH7. 0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀 水溶液組成。所述超滲除鹽采用30KDa的濾膜進行超滲除鹽。應用所述藻藍蛋白提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。本專利技術所具有的優點本專利技術依次采用硫酸銨沉淀、雙水相萃取和超滲除鹽，避免了傳統層析技術的弊端，可以大規模生產藻藍蛋白提取物。將所得藻藍蛋白提取物采用灌 胃的方式將其對S180肉瘤小鼠進行不同劑量給藥，結果表現出良好的腫瘤抑制效果，并且 對脾臟和胸腺并沒有表現出明顯的毒性。與傳統的化療藥物(環磷酰胺)相比較，其水溶 性好、毒副作用低、給藥方便。附圖說明圖la.為本專利技術實施例制備過程各樣品的紫外可見光譜表征圖。圖lb.為本專利技術實施例制備藻藍蛋白提取物的熒光光譜表征圖。圖2a.為本專利技術實施例制備所得藻藍蛋白提取物硫酸鋅染色紫外成像電泳表征 圖。圖2b.為本專利技術實施例制備所得藻藍蛋白提取物考馬斯亮藍染色成像電泳表征 圖。圖3a.為本專利技術實施例例制備所得藻藍蛋白提取物在4°C時不同PH值磷酸鹽溶液 中的光譜穩定性圖。圖3b.為本專利技術實施例例制備所得藻藍蛋白提取物在25°C時不同pH值磷酸鹽溶 液中的光譜穩定性圖。具體實施例方式藻藍蛋白提取物以螺旋藻藻粉為原料制備的藻藍蛋白提取物主要由藻藍蛋白組成。其水溶液的吸 光度特點為 A6207280 ^ 3.0 + 0.2, A6207650 ^ 2.2 + 0. I0所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇 和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、干燥的條件 下長期保存。實施例1制備稱取IOg市售螺旋藻藻粉(深圳生物科技公司)，懸浮于150mL水中攪拌混勻后， 于-20 4°C反復凍融三次，破碎螺旋藻細胞壁，得到粗提物。將所得粗提物在9000rpm下離 心IOmin取上清。將上清液中加入約44克硫酸銨，充分攪拌溶解，4°C靜置4h后，9000rpm， 離心IOmin棄上清。所得沉淀用30mL純水溶解后，采用雙水相萃取純化蛋白質粗提物，其中 雙水相萃取條件為1.2kg雙水相體系，其中各組成的質量分數分別為4%的PEG、15%的氯 化鉀、10%的pH 7. 0磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀水溶液，充分振蕩后，在40°C靜置2小時充分 分層取上相。將上清液利用30KDa的濾膜超滲除鹽，純化后蛋白溶液冷凍干燥得到可以室 溫保存的螺旋藻藻粉提取的藻藍蛋白提取物。藻藍蛋白提取物中主要成分為藻藍蛋白，(參 見圖la、b和圖2a、b)，其水溶液的吸光度特點為A62Q/28Q 3. 0士0. 2，A6207650 2. 2士0. 1。該方法將硫酸銨沉淀、雙水相萃取和超滲等多種方法結合，避免了傳統層析柱技 術的弊端，有利于規模放大和工業生產。此外，本方法中硫酸銨沉淀后樣品無需除鹽，直接 溶解進而通過一次雙水相萃取技術，共同透析除鹽實現了藻藍蛋白提取物的制備，將藻藍 蛋白的純度提高了 6倍，與文獻對比，提高了純度效率，同時簡化了操作步驟。其中文獻為 Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001, 76 1273-1280.所述藻藍蛋白提取物為藍色粉末狀固體，略有螺旋藻腥味，易溶于水，微溶于乙醇 和甲醇；其lmg/mL的水溶液在25°C時，相對黏度為1. 03士0. 01 ；在室溫、避光、干燥的條件 下長期保存。圖Ia為室溫下測定的制備過程中所得提取物水溶液的紫外可見吸收光譜。如圖 所示，反復凍融法破碎螺旋藻細胞后離心上清在260nm處具有較強的吸收峰，其A62W約為 0. 5，表明藻藍蛋白的純度很低，其中含有較多的核酸分子；經過硫酸銨沉淀的蛋白質粗提 物在260nm處的吸收峰相對降低，A62(i/28(i相對提高，這表明硫酸銨沉淀除去了部分核酸分子 和雜蛋白；經過雙水相萃取并超滲除鹽后得到的藻藍蛋白提取物在280nm和620nm處有明 顯的吸收峰，A6207280約為3. 0，A6207650約為2. 2，這表明雙水相萃取和超滲步驟進一步出去了 核酸分子和雜蛋白，所得到藻藍蛋白提取物中主要成分為藻藍蛋白。圖Ib為室溫下測定的藻藍蛋白提取物水溶液的熒光光譜。如圖所示，該藻藍蛋白 提取物在500nm的光激發條件下，其熒光發射峰在640nm處，這進一步證明了藻藍蛋白提取 物中主要本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種藻藍蛋白提取物，其特征為：將螺旋藻粉在－２０℃～４℃下通過反復凍融法破碎螺旋藻細胞壁得到粗提物；用質量分數為５０－６０％的硫酸銨沉淀粗提液得到蛋白質粗提物；而后采用雙水相萃取純化蛋白質粗提物，并用超滲除鹽，即得藻藍蛋白提取物溶液。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳英杰，秦松，李富超，郭雪潔，劉少芳，董曉弟，
申請(專利權)人：中國科學院海洋研究所，
類型：發明
國別省市：95[中國|青島]